в чем смысл удвоения днк
ДНК и гены
ДНК ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ
Справа крупнейшая спираль ДНК человека, выстроенная из людей на пляже в Варне (Болгария), вошедшая в книгу рекордов Гиннесса 23 апреля 2016 года
Дезоксирибонуклеиновая кислота. Общие сведения
Дезоксирибонуклеи́новая кислота (ДНК) — макромолекула (одна из трёх основных, две другие — РНК и белки), обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков.
В клетках эукариот (животных, растений и грибов) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом, а также в некоторых клеточных органоидах (митохондриях и пластидах). В клетках прокариотических организмов (бактерий и архей) кольцевая или линейная молекула ДНК, так называемый нуклеоид, прикреплена изнутри к клеточной мембране. У них и у низших эукариот (например, дрожжей) встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами.
С химической точки зрения ДНК — это длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счёт дезоксирибозы (С) и фосфатной (Ф) группы (фосфодиэфирные связи).
Рис. 2. Нуклертид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы
В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула закручена по винтовой линии.
В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином (А-Т), гуанин — только с цитозином (Г-Ц). Именно эти пары и составляют «перекладины» винтовой «лестницы» ДНК (см.: рис. 2, 3 и 4).
Рис. 2. Азотистые основания
Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию о различных типах РНК, наиболее важными из которых являются информационные, или матричные (мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на матрице ДНК за счёт копирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции, и принимают участие в биосинтезе белков (процессе трансляции). Помимо кодирующих последовательностей, ДНК клеток содержит последовательности, выполняющие регуляторные и структурные функции.
Рис. 3. Репликация ДНК
Расположение базовых комбинаций химических соединений ДНК и количественные соотношения между этими комбинациями обеспечивают кодирование наследственной информации.
Образование новой ДНК (репликация)
По завершении дупликации образуются две самостоятельные спирали, созданные из химических соединений родительской ДНК и имеющие с ней одинаковый генетический код. Таким путем ДНК способна перерывать информацию от клетки к клетке.
Более подробная информация:
СТРОЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) относится к нуклеиновым кислотам. Нуклеиновые кислоты – это класс нерегулярных биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды.
НУКЛЕОТИДЫ состоят из азотистого основания, соединенного с пятиуглеродным углеводом (пентозой) – дезоксирибозой (в случае ДНК) или рибозой (в случае РНК), который соединяется с остатком фосфорной кислоты (H2PO3–).
Азотистые основания бывают двух типов: пиримидиновые основания – урацил (только в РНК), цитозин и тимин, пуриновые основания – аденин и гуанин.
Рис. 5. Структура нуклеотидов (слева), расположение нуклеотида в ДНК (снизу) и типы азотистых оснований (справа): пиримидиновые и пуриновые
Атомы углерода в молекуле пентозы нумеруются числами от 1 до 5. Фосфат соединяется с третьим и пятым атомами углерода. Так нуклеинотиды соединяются в цепь нуклеиновой кислоты. Таким образом, мы можем выделить 3’ и 5’-концы цепи ДНК:
Рис. 6. Выделение 3’ и 5’-концов цепи ДНК
Две цепи ДНК образуют двойную спираль. Эти цепи в спирали сориентированы в противоположных направлениях. В разных цепях ДНК азотистые основания соединены между собой с помощью водородных связей. Аденин всегда соединяется с тимином, а цитозин – с гуанином. Это называется правилом комплементарности (см. принцип комплементарности ).
Правило комплементарности:
| A–T G–C |
Например, если нам дана цепь ДНК, имеющая последовательность
3’– ATGTCCTAGCTGCTCG – 5’,
то вторая ей цепь будет комплементарна и направлена в противоположном направлении – от 5’-конца к 3’-концу:
5’– TACAGGATCGACGAGC– 3’.
Рис. 7. Направленность цепей молекулы ДНК и соединение азотистых оснований с помощью водородных связей
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК
Репликация ДНК – это процесс удвоения молекулы ДНК путем матричного синтеза. В большинстве случаев естественной репликации ДНК праймером для синтеза ДНК является короткий фрагмент РНК (создаваемый заново). Такой рибонуклеотидный праймер создается ферментом праймазой (ДНК-праймаза у прокариот, ДНК-полимераза у эукариот), и впоследствии заменяется дезоксирибонуклеотидами полимеразой, выполняющей в норме функции репарации (исправления химических повреждений и разрывов в молекле ДНК).
Репликация происходит по полуконсервативному механизму. Это значит, что двойная спираль ДНК расплетается и на каждой из ее цепей по принципу комплементарности достраивается новая цепь. Дочерняя молекула ДНК, таким образом, содержит в себе одну цепь от материнской молекулы и одну вновь синтезированную. Репликация происходит в направлении от 3’ к 5’ концу материнской цепи.
Рис. 8. Репликация (удвоение) молекулы ДНК
ДНК-синтез – это не такой сложный процесс, как может показаться на первый взгляд. Если подумать, то для начала нужно разобраться, что же такое синтез. Это процесс объединения чего-либо в одно целое. Образование новой молекулы ДНК проходит в несколько этапов:
Рис. 9. Схематическое изображение процесса репликации ДНК: (1) Отстающая цепь (запаздывающая нить), (2) Ведущая цепь (лидирующая нить), (3) ДНК-полимераза α ( Polα ), (4) ДНК-лигаза, (5) РНК-праймер, (6) Праймаза, (7) Фрагмент Оказаки, (8) ДНК-полимераза δ ( Polδ ), (9) Хеликаза, (10) Однонитевые ДНК-связывающие белки, (11) Топоизомераза.
Далее описан синтез отстающей цепи дочерней ДНК (см. Схему репликативной вилки и функции ферментов репликации)
Нагляднее о репликации ДНК см. видео →
5) Непосредственно сразу после расплетания и стабилизации другой нити материнской молекулы к ней присоединяется ДНК-полимераза α (альфа) и в направлении 5’→3′ синтезирует праймер (РНК-затравку) – последовательность РНК на матрице ДНК длиной от 10 до 200 нуклеотидов. После этого фермент удаляется с нити ДНК.
СТРОЕНИЕ РНК
Рибонуклеиновая кислота (РНК) — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов.
Последовательность нуклеотидов позволяет РНК кодировать генетическую информацию. Все клеточные организмы используют РНК (мРНК) для программирования синтеза белков.
Затем матричные РНК (мРНК) принимают участие в процессе, называемом трансляцией, т.е. синтеза белка на матрице мРНК при участии рибосом. Другие РНК после транскрипции подвергаются химическим модификациям, и после образования вторичной и третичной структур выполняют функции, зависящие от типа РНК.
Рис. 10. Отличие ДНК от РНК по азотистому основанию: вместо тимина (Т) в РНК представлен урацил (U), который также комплементарен аденину.
ТРАНСКРИПЦИЯ
Транскрипция – это процесс синтеза РНК на матрице ДНК. ДНК раскручивается на одном из участков. На одной из цепей содержится информация, которую необходимо скопировать на молекулу РНК – эта цепь называется кодирующей. Вторая цепь ДНК, комплементарная кодирующей, называется матричной. В процессе транскрипции на матричной цепи в направлении 3’ – 5’ (по цепи ДНК) синтезируется комплементарная ей цепь РНК. Таким образом, создается РНК-копия кодирующей цепи.
Рис. 11. Схематическое изображение транскрипции
Например, если нам дана последовательность кодирующей цепи
3’– ATGTCCTAGCTGCTCG – 5’,
то, по правилу комплементарности, матричная цепь будет нести последовательность
5’– TACAGGATCGACGAGC– 3’,
а синтезируемая с нее РНК – последовательность
3’– AUGUCCUAGCUGCUCG – 5’.
ТРАНСЛЯЦИЯ
Рассмотрим механизм синтеза белка на матрице РНК, а также генетический код и его свойства. Также для наглядности по ниже приведенной ссылке рекомендуем посмотреть небольшое видео о процессах транскрипции и трансляции, происходящих в живой клетке:
Рис. 12. Процесс синтеза белка: ДНК кодирует РНК, РНК кодирует белок
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД
Генетический код, общий для большинства про- и эукариот. В таблице приведены все 64 кодона и указаны соответствующие аминокислоты. Порядок оснований — от 5′ к 3′ концу мРНК.
Таблица 1. Стандартный генетический код
Среди триплетов есть 4 специальных последовательности, выполняющих функции «знаков препинания»:
Свойства генетического кода
1. Триплетность. Каждая аминокислота кодируется последовательностью из трех нуклеотидов – триплетом или кодоном.
2. Непрерывность. Между триплетами нет никаких дополнительных нуклеотидов, информация считывается непрерывно.
3. Неперекрываемость. Один нуклеотид не может входить одновременно в два триплета.
4. Однозначность. Один кодон может кодировать только одну аминокислоту.
5. Вырожденность. Одна аминокислота может кодироваться несколькими разными кодонами.
6. Универсальность. Генетический код одинаков для всех живых организмов.
Пример. Нам дана последовательность кодирующей цепи:
3’– CCGATTGCACGTCGATCGTATA– 5’.
Матричная цепь будет иметь последовательность:
5’– GGCTAACGTGCAGCTAGCATAT– 3’.
Теперь «синтезируем» с этой цепи информационную РНК:
3’– CCGAUUGCACGUCGAUCGUAUA– 5’.
Синтез белка идет в направлении 5’ → 3’, следовательно, нам нужно перевернуть последовательность, чтобы «прочитать» генетический код:
5’– AUAUGCUAGCUGCACGUUAGCC– 3’.
Теперь найдем старт-кодон AUG:
5’– AU AUG CUAGCUGCACGUUAGCC– 3’.
Разделим последовательность на триплеты:
Найдем стоп-кодон и согласно таблице генетического кода запишем последовательность аминокислот:
Центральная догма молекулярной биологии звучит следующим образом: информация с ДНК передается на РНК (транскрипция), с РНК – на белок (трансляция). ДНК также может удваиваться путем репликации, и также возможен процесс обратной транскрипции, когда по матрице РНК синтезируется ДНК, но такой процесс в основном характерен для вирусов.
Рис. 13. Центральная догма молекулярной биологии
ГЕНОМ: ГЕНЫ и ХРОМОСОМЫ
Термин «геном» был предложен Г. Винклером в 1920 г. для описания совокупности генов, заключенных в гаплоидном наборе хромосом организмов одного биологического вида. Первоначальный смысл этого термина указывал на то, что понятие генома в отличие от генотипа является генетической характеристикой вида в целом, а не отдельной особи. С развитием молекулярной генетики значение данного термина изменилось. Известно, что ДНК, которая является носителем генетической информации у большинства организмов и, следовательно, составляет основу генома, включает в себя не только гены в современном смысле этого слова. Большая часть ДНК эукариотических клеток представлена некодирующими («избыточными») последовательностями нуклеотидов, которые не заключают в себе информации о белках и нуклеиновых кислотах. Таким образом, основную часть генома любого организма составляет вся ДНК его гаплоидного набора хромосом.
Гены — это участки молекул ДНК, кодирующие полипептиды и молекулы РНК
За последнее столетие наше представление о генах существенно изменилось. Ранее геном называли участок хромосомы, кодирующий или определяющий один признак или фенотипическое (видимое) свойство, например цвет глаз.
В 1940 г. Джордж Бидл и Эдвард Тейтем предложили молекулярное определение гена. Ученые обрабатывали споры гриба Neurospora crassa рентгеновским излучением и другими агентами, вызывающими изменения в последовательности ДНК (мутации), и обнаружили мутантные штаммы гриба, утратившие некоторые специфические ферменты, что в некоторых случаях приводило к нарушению целого метаболического пути. Бидл и Тейтем пришли к выводу, что ген — это участок генетического материала, который определяет или кодирует один фермент. Так появилась гипотеза «один ген — один фермент». Позднее эта концепция была расширена до определения «один ген — один полипептид», поскольку многие гены кодируют белки, не являющиеся ферментами, а полипептид может оказаться субъединицей сложного белкового комплекса.
Современное биохимическое определение гена еще более конкретно. Генами называются все участки ДНК, кодирующие первичную последовательность конечных продуктов, к которым относятся полипептиды или РНК, обладающие структурной или каталитической функцией.
Наряду с генами ДНК содержит и другие последовательности, выполняющие исключительно регуляторную функцию. Регуляторные последовательности могут обозначать начало или конец генов, влиять на транскрипцию или указывать место инициации репликации или рекомбинации. Некоторые гены могут экспрессироваться разными путями, при этом один и тот же участок ДНК служит матрицей для образования разных продуктов.
Мы можем приблизительно рассчитать минимальный размер гена, кодирующего средний белок. Каждая аминокислота в полипептидной цепи кодируется последовательностью из трех нуклеотидов; последовательности этих триплетов (кодонов) соответствуют цепочке аминокислот в полипептиде, который кодируется данным геном. Полипептидная цепь из 350 аминокислотных остатков (цепь средней длины) соответствует последовательности из 1050 п.н. (пар нуклеотидов). Однако многие гены эукариот и некоторые гены прокариот прерываются сегментами ДНК, не несущими информации о белке, и поэтому оказываются значительно длиннее, чем показывает простой расчет.
Сколько генов в одной хромосоме?
ДНК прокариот устроена более просто: их клетки не имеют ядра, поэтому ДНК находится непосредственно в цитоплазме в форме нуклеоида.
Как известно, бактериальные клетки имеют хромосому в виде нити ДНК, уложенной в компактную структуру – нуклеоид. Хромосома прокариота Escherichia coli, чей геном полностью расшифрован, представляет собой кольцевую молекулу ДНК (на самом деле, это не правильный круг, а скорее петля без начала и конца), состоящую из 4 639 675 п.н. В этой последовательности содержится примерно 4300 генов белков и еще 157 генов стабильных молекул РНК. В геноме человека примерно 3,1 млрд пар нуклеотидов, соответствующих почти 29 000 генам, расположенным на 24 разных хромосомах.
Прокариоты (Бактерии).
Бактерия E. coli имеет одну двухцепочечную кольцевую молекулу ДНК. Она состоит из 4 639 675 п.н. и достигает в длину примерно 1,7 мм, что превышает длину самой клетки E. coli приблизительно в 850 раз. Помимо крупной кольцевой хромосомы в составе нуклеоида многие бактерии содержат одну или несколько маленьких кольцевых молекул ДНК, свободно располагающихся в цитозоле. Такие внехромосомные элементы называют плазмидами (рис. 16).
Большинство плазмид состоит всего из нескольких тысяч пар нуклеотидов, некоторые содержат более 10000 п. н. Они несут генетическую информацию и реплицируются с образованием дочерних плазмид, которые попадают в дочерние клетки в процессе деления родительской клетки. Плазмиды обнаружены не только в бактериях, но также в дрожжах и других грибах. Во многих случаях плазмиды не дают никаких преимуществ клеткам-хозяевам, и их единственная задача — независимое воспроизведение. Однако некоторые плазмиды несут полезные для хозяина гены. Например, содержащиеся в плазмидах гены могут придавать клеткам бактерий устойчивость к антибактериальным агентам. Плазмиды, несущие ген β-лактамазы, обеспечивают устойчивость к β-лактамным антибиотикам, таким как пенициллин и амоксициллин. Плазмиды могут переходить от клеток, устойчивых к антибиотикам, к другим клеткам того же или другого вида бактерий, в результате чего эти клетки также становятся резистентными. Интенсивное применение антибиотиков является мощным селективным фактором, способствующим распространению плазмид, кодирующих устойчивость к антибиотикам (а также транспозонов, которые кодируют аналогичные гены) среди болезнетворных бактерий, и приводит к появлению бактериальных штаммов с устойчивостью к нескольким антибиотикам. Врачи начинают понимать опасность широкого использования антибиотиков и назначают их только в случае острой необходимости. По аналогичным причинам ограничивается широкое использование антибиотиков для лечения сельскохозяйственных животных.
Эукариоты.
Таблица 2. ДНК, гены и хромосомы некоторых организмов
Что такое ДНК, или почему каждый из нас наполовину банан
Эту аббревиатуру мы слышим довольно часто, но мало кто пытается вникнуть и понять, что же такое ДНК. ДНК расшифровывается как дезоксирибонуклеиновая кислота, но понимания это особо не прибавляет. Будем разбираться дальше.
ДНК – это полимерная молекула. С точки зрения химии – это двойная спираль, которая складывается из нескольких блоков нуклеотидов, повторяющихся много-много раз. А две спирали связаны между собой водородными связями. На самом деле ДНК отнесли к разряду молекул только лишь для удобства, поскольку она во много раз больше стандартных молекул.
Существует всего 4 вида нуклеотидов: аденин, тимин, гуанин, цитозин. И именно в их последовательности и зашифрована генетическая «инструкция» для развития живого организма, то есть вся генетическая информация. Именно молекула ДНК сообщает каждой клетке нашего организма, какие белки и в каком количестве необходимо производить.
Цепочки ДНК закручиваются в спирали тоже неспроста. Это помогает уменьшить длину спирали в 5-6 раз, чтобы более компактно «упаковать» всю генетическую информацию. Ученые подсчитали, что если раскрутить спирали ДНК, то они растянутся на 16 млрд километров (это расстояние от Земли до Плутона и обратно). А если кто-то захочет напечатать геном человека, то на это уйдет 50 лет, если непрерывно набирать текст на компьютере по 8 часов каждый день.
В 99.9% ДНК всех людей на планете одинаковы, а наши различия обусловлены только 0,1%! Удивительно, не так ли? На этом примере очень хорошо понятно, какое огромное количество информации заложено в ДНК, если даже 0,1% отвечает за такое огромное количество различий между всеми людьми на планете. Да что там с людьми. Это покажется комичным, но 50% человеческого ДНК полностью схожа с ДНК банана, а число генов у человека ненамного больше генов у круглого червя.
Разумеется, одна, пусть даже очень большая двойная спираль, не может вместить в себя всю генетическую информацию о человеческом организме. Именно поэтому цепочки составляют пару, которая внешне напоминает букву «Х». Уникальная последовательность из нуклеотидов в одной из двух спиралей ДНК называется геном. Если даже незначительно изменить последовательность в нем, то ген будет поврежден или разрушен, в результате у человека может возникнуть генетическое заболевание.
А не замахнуться ли нам на. изменение генома?
А не замахнуться ли нам на. изменение генома?
Ученые научились редактировать молекулу ДНК в интересующем месте
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Человек стремится покорить природу, и ключ для этого — ДНК. Но чтобы подобраться к молекуле ДНК и повлиять на нее, необходимо использовать точнейшие молекулярные инструменты — белки или РНК. В этой статье рассказывается о новейшем инструменте для внесения мутаций в геном in vivo — сиквенс-cпецифичных нуклеазах.
Конкурс «био/мол/текст»-2013
Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2013 в номинации «Лучший обзор».
Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.
История изучения ДНК непроста, как и любое значительное исследование. Открыта она была еще в 1868 году Иоганном Фридрихом Мишером, который выделил некое вещество, содержащее азот и фосфор, из остатков клеток в гное [1]. После того, как Мишер обнаружил, что оно обладает кислотными свойствами, вещество назвали нуклеиновой кислотой. Однако долгое время функция ДНК была неясной: ее считали всего лишь способом запасания фосфора в организме. Данная теория считалась правильной почти до середины XX века; в качестве косвенного доказательства ученые ссылались на однообразное, по их мнению, строение молекулы ДНК (состоящей исключительно из четырех различных видов нуклеотидов: дезоксиаденозина — А, дезоксигуанозина — G, дезокситимидина — Т, дезоксицитидина — С).
Функцию ДНК, естественно, открыли раньше, чем ее вторичную структуру, которая оставалась неизвестной вплоть до 1953 года. Соответственно, из-за этого не могли установить, как проходят такие процессы как передача наследственной информации, как белки распознают определенные последовательности в ДНК и т.п.
В 1949–1951 годах Эрвин Чаргафф сформулировал свои знаменитые правила, которые говорят о строгом соотношении количества азотистых оснований внутри каждой молекулы ДНК [4] (в частности, что количество аденина равняется количеству тимина, а количество цитозина — количеству гуанина); затем Морисом Уилкинсом и Розалиндой Франклин были получены рентгеноструктурные данные, несущие структурную информацию о ДНК. На основании этих двух фактов Френсис Крик и Джеймс Уотсон предложили структуру двойной спирали ДНК [5], которая была доказана позднее в опытах Мэтью Мезельсона и Франклина Сталя [6].
Как только была открыта вторичная структура ДНК, стало легче предсказывать, а затем доказывать экспериментами механизмы различных процессов, происходящих с ДНК. Репликация (удвоение молекулы ДНК), транскрипция (перенос генетической информации с ДНК на РНК), различная регуляция экспрессии генов стали главными проблемами, интересующими молекулярных биологов.
Очевидно, что для осуществления этих процессов необходимы определенные белки, которые, в свою очередь, взаимодействуют как друг с другом, так и с ДНК. И если некоторые стадии протекают неспецифично (например, у эукариот репликация ДНК может начаться во множестве участков ДНК [7]), то, например, регуляция экспрессии генов происходит с помощью взаимодействия белков с довольно консервативными, т.е. строгими последовательностями ДНК.
Эндонуклеазы рестрикции: «Режем ДНК в нужном вам месте!»
Одними из первых открытых белков, специфически связывающих ДНК, являются эндонуклеазы рестрикции. Это ферменты, которые разрезают ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям, называемым сайтами рестрикции (рис. 1) [8].
Рисунок 1. Рестрикция с образованием а) «тупых» концов; б) «липких» концов
Сам термин «рестрикция» появился благодаря исследованиям фага λ и феномена контролируемой рестрикции и модификации бактериальных вирусов клетками-хозяевами. Этот процесс был впервые обнаружен в результате работ Сальвадора Лурии [9] и Джузеппе Бертани [10] в 1950-х годах. Ученые обнаружили, что если фаг λ хорошо растет в одном штамме Escherichia coli, то в другом штамме его рост падает на несколько порядков, т.е. клетка-хозяин может снижать его биологическую активность. Оказалось, что запрет роста — «рестрикция» — вызывается ферментативным расщеплением ДНК фага. Соответственно, и фермент, отвечающий за этот процесс, назвали ферментом рестрикции.
Сами ферменты были обнаружены в лабораториях Вернера Арбера и Мэттью Мезельсона [11]; причем эндонуклеазы, которые исследовались в их работах, принадлежали, как определили позже, к I классу эндонуклеаз рестрикции. Они разрезают ДНК в случайном месте снаружи от места распознавания, причем как минимум на расстоянии 1000 нуклеотидов.
В 1970-х годах Гамильтон Смит, Томас Келли и Кент Велкокс выделили и охарактеризовали первую эндонуклеазу рестрикции II класса. Этот тип ферментов рестрикции более удобен для лабораторного использования, поскольку расщепляет ДНК внутри своего сайта распознавания, который, как правило, представляет собой палиндром из 4–8 нуклеотидов. Кроме того, эндонуклеазы этого класса не нуждаются в энергетической молекуле АТФ для активности, — только в ионах магния в качестве кофактора.
В 1990-х и ранних 2000-х годах были открыты другие представители данного семейства, которые не соответствовали всем критериям этого класса ферментов [12]. На данный момент уже открыты эндонуклеазы типов IIB, IIE, IIF, IIG, IIM, IIS, IIT. Возможно, в будущем этот список еще значительно расширится.
Существует также III класс эндонуклеаз рестрикции. Они были также открыты как компоненты прокариотической защитной системы против чужеродной ДНК. Эндонуклеазы III типа распознают две отдельных последовательности ДНК длиной 5–6 нуклеотидов и разрезают её примерно через 20–30 пар после сайта распознавания. Для их работы необходимы молекулы АТФ.
Эндонуклеазы рестрикции используют для обработки ДНК в различных лабораторных экспериментах. Обычно их применяют для вставки генов в процессах генного клонирования и экспериментах по исследованию белков.
Кроме того, эндонуклеазы могут быть использованы для выявления различий в аллелях гена [13]. Это возможно только в случае, если мутация произойдет в сайте узнавания, содержащемся внутри аллеля. Таким образом, отпадает нужда в дорогостоящем секвенировании гена; в частности, до изобретения секвенирования обработка эндонуклеазами рестрикции использовалась для картирования геномов.
Одно из новейших применений нуклеаз — внесение с помощью них различных изменений в геном клетки, таких как мутации уже имеющихся генов, вставка новых генов или вырезание исходных. Это очень перспективное направление генной инженерии с широчайшими возможностями практического применения! О нем будет рассказано в следующем разделе.
Эндонуклеазы — это эффекторы, т.е. белки действия. Если они окажутся у цели, то точно ее разрежут. Но природные белки распознают лишь небольшое число последовательностей ДНК, что накладывает огромные ограничения на использование этого уникального инструмента. Ах, если бы можно было доставить эндонуклеазу к любой желаемой последовательности ДНК.
Революция в области ДНК-связывающих белков: «Доставим ваш белок по любому адресу ДНК, используя TAL-эффекторы или CRISPR/Cas9-систему»
Одной из наиболее заманчивых идей для ученых является возможность напрямую точечно влиять на работу клетки. Для этого необходимо прицельно воздействовать на ДНК именно в области интересующего гена. Воздействие может быть разного характера: включение/выключение гена, внесение мутации и др. Для этого потребовалось уметь синтезировать белки, узнающие конкретную последовательность ДНК («следопыты»), к которым можно было бы пришить белки «действия».
Недавно открытые белки TAL-эффекторы и система Cas9 произвели настоящую революцию в нацеливании различных эффекторов на специфическую последовательность ДНК!
TAL-эффекторы: «Используем паразитов во благо»
TAL-эффекторы (Transcription Activator Like Effectors) — белки, синтезируемые многочисленным видами бактерий рода Xanthomonas — паразитами растений. Они были открыты в 2009 году практически одновременно несколькими группами ученых. TAL-эффекторы активируют считывание нужных паразитам генов в растениях-хозяевах (крайне специфично связываясь с хозяйской ДНК), что облегчает бактериальную колонизацию этого растения и выживание бактерий внутри него [14].
TAL-эффектор можно мысленно поделить на три части (рис. 2); наибольший интерес представляет средняя, крайне консервативная центральная область белка, состоящая из повторяющихся блоков размером 34 аминокислоты. В 2009 же году была показана простая и однозначная связь между повторами и узнаваемыми нуклеотидами. Блоки отличаются друг от друга лишь аминокислотами № 12 и № 13, которые и определяют вид нуклеотида, распознаваемый данным мономером. На каждый из четырех нуклеотидов ДНК приходится определенное сочетание этих аминокислот TAL-эффектора [15]; т.е. можно представить себе этот белок как паровозик, состоящий из одинаковых вагонов, центральное окошко которых покрашено в один из четырех цветов.
Рисунок 2. Строение TAL-эффектора на примере avrBs3
Простота «TALE-кода» открывает многочисленные возможности для биологического применения этих белков. Недавние исследования показали, что можно специально подобрать «вагоны» для искусственного «паровозика» и синтезировать ранее не существовавшие в природе белки для узнавания конкретных последовательностей ДНК в различных типах клеток — как растений, так и млекопитающих. Многие группы ученых уже используют искусственные TAL-эффекторы, узнающие новые последовательности ДНК, например, в томатах, Arabidopsis thaliana [16] и клетках человека [17].
Синтезированные TAL-эффекторы также сшивают с каталитическим доменом нуклеазы (см. раздел «Эндонуклеазы рестрикции») для создания TAL-эффекторных нуклеаз. Эти нуклеазы могут быть полезны для генной инженерии и генной терапии [18].
TAL-нуклеазы используют для создания двуцепочечных разрывов в строго определенном месте ДНК. Известно, что нарушенные таким образом гены клетка может чинить двумя путями: либо просто соединением концов (что может привести к случайным мутациям), либо заново синтезируя поврежденную цепь по комплементарной ей цепи ДНК (т.н. гомологичная рекомбинация).
Во втором случае вырезается значительный по длине участок ДНК, а вместо него по комплементарной (на краях разрыва) матрице синтезируется вставка, закрывающая брешь [19]. Если в клетку поместить ДНК специально мутированного гена, то он будет использован в качестве донорной матрицы, и в геном встроится желаемая мутация. Можно таким методом даже вырезать отдельные гены — или вставлять новые! Таким образом, благодаря разработанной технике сборки ДНК-узнающих повторов, TAL-эффекторы в составе гибридных белков предоставляют возможность направить желаемый эффектор к любой специфической последовательности ДНК — и добиться самых разных воздействий на ДНК: от регуляции транскрипции до внесений мутаций.
CRISPR/Cas9 система: «Неожиданное альтернативное применение защитного комплекса бактерий»
В нашем организме, после того, как мы переболели какой-то болезнью, остаются клетки памяти иммунной системы, которые при повторном попадании в организм вредителей активизируются и помогают ускоренно справиться с ними.
Бактерии справляются со своими патогенами с помощью аналогичной «системы памяти»: CRISPR/Cas-системы обеспечивают иммунитет бактерий и архей против вирусов и плазмид. Этот защитный комплекс состоит из:
Этот комплекс был открыт в 2012 году при совместной работе ученых из США, Швейцарии, Австрии и Швеции [20], [21].
Иммунитет, обусловленный CRISPR/Cas, возникает за три стадии (рис. 3). В первой фазе бактерии или археи, у которых в геноме есть «блокнотик для записи» — CRISPR-кассета, — отвечают на появление вируса включением в конец кассеты коротких фрагментов чужеродной ДНК. На следующей стадии происходит транскрипция — считывание этой свежевключенной последовательности (образование описанных выше двух РНК) и обработка их нуклеазами. Теперь эти РНК могут специфично связаться с вирусной ДНК, и это взаимодействие через цепь событий приводит к ее расщеплению и «смерти» вредителя.
Рисунок 3. Схема работы комплекса Cas—РНК и CRISPR-кассеты
Грубо говоря, ситуация напоминает сказку про репку: первая РНК связывается с «репкой» — чужеродной ДНК — и «зовёт» вторую, вторая — специальный белок Cas9, который уже осуществляет двухцепочечный разрыв цепи чужой ДНК [22].
Несмотря на то, что в природе две РНК системы Cas9 разделены, учёные показали, что химерная РНК, представляющая собой сшитые в одну цепь вышеуказанные РНК, так же способна направлять Cas9 к ДНК-мишени. Более того, при соблюдении ряда условий можно менять последовательность первой внутри химерной РНК так, чтобы нацеливать Cas9 на желаемые гены.
Эта система даже проще TAL-эффекторов, поскольку для распознавания одного дезоксирибонуклеотида ДНК не нужен громоздкий «вагон» белка: один рибонуклеотид РНК легко и точно узнаёт комплементарный ему дезоксирибонуклеотид ДНК мишени! Экономия как в размере инструмента, так и в легкости его синтеза.
К настоящему времени показано, что эта система работает не только в археях и бактериях, но и в организмах рыб (Danio rerio), а также в клетках млекопитающих [23]. Уже установлено, что, как и в случае TAL-эффекторных нуклеаз, обработка ДНК Cas9-системой приводит к эффективному (10–30% случаев) возникновению мутаций.
Человек стремится покорить природу, и ключ для этого — ДНК. Но чтобы подобраться к ДНК и повлиять на нее, необходимо спуститься на молекулярный уровень и использовать белки или РНК. Сейчас развитие данных направлений идет стремительно, каждый месяц случаются значительные прорывы в этой области. Кто знает, какие чудеса ожидают нас через год? Возможно, будет найдена новая система, максимально упрощающая исходно сложный и кропотливый процесс вмешательства человека в работу природы.