выделение днк для чего нужно
Анализ ДНК слюны, методика определения
Статья опубликована: 2018-08-28
Рейтинг: 5 из 5
В современном мире тесты ДНК используют по разным причинам:
Для получения результата нужно сдать образец биоматериала, который можно собрать как в лаборатории, так и самостоятельно. Сегодня эта процедура занимает лишь несколько секунд, так как для выделения фрагментов ДНК достаточно эпителия с внутренней стороны щеки. А если речь идет о беременных, то у них берут 20 миллилитров венозной крови. Такие образцы называются стандартными и находятся на первом месте в списке возможного биоматериала для анализа ДНК. Но в некоторых случаях клиент не может сдать такой материал, потому что второй участник процедуры не хочет в ней участвовать. В подобных ситуациях приходится прибегать к нестандартным образцам.
Можно ли сделать тест ДНК по слюне
Слюна – это нестандартный образец, который содержит столько же фрагментов ДНК, как и волосы, ногти, эпителий. Поэтому ее можно использовать для проведения процедуры. Но чтобы получить верный результат, нужно придерживаться основного правила – защитить образец от попадания частичек из вне. Чаще всего со слюной сдают жвачки. Этот материал пакуют в герметичный пакет и следят затем, чтобы туда не попали кусочки кожи, кровь и разные частицы. Поэтому за образец не стоит браться голыми руками. Человек может даже не заметить, что у него отшелушился кусочек кожи или же на пальце есть маленькая царапина, из которой вытекла капелька крови.
Если правильно провести сбор и предоставить достаточное количество материала, генетики дадут заключение, выполнив стандартную процедуру. Кстати, на точность результата не влияет количество материала. От объема зависит только то, смогут ли молекулярные биологи выделить фрагменты ДНК или нет. Если эта часть процедуры прошла успешно, результат будет верным на 99,9999 процента.
Как проходит процедура и меняется ли ее стоимость в зависимости от вида образца
Для получения ДНК из слюны не требуется специального оборудования. Поэтому такой анализ стоит столько же, сколько расшифровка фрагментов, полученных из стандартного образца. На первом этапе врачи выделяют фрагменты с помощью специальных центрифуг и сортировщиков фрагментов. Затем начинается анализ локусов с применением специальных реагентов. Важно, чтобы ни были качественными, поскольку от этого во многом зависит точность анализа ДНК на отцовство. Вот почему не стоит обращаться в центры с плохим имиджем. Без сертифицированного оборудования и необходимых веществ, работники такого заведения не смогут гарантировать точность результата 99,9999 процентов.
Кроме того, центры с сомнительной репутацией часто не имеют достаточно врачей в штате. Из-за этого они не могут работать двумя независимыми группами. А только так возможно избавиться от риска влияния «человеческого фактора» на окончательное заключение. Генетики должны сделать выводы, сравнить их и лишьпотом выдавать бумаги, которые подтверждают или опровергают отцовство, родство, принадлежность к национальности.
Часто подобный тест проводится, чтобы предъявить документ в суде и выиграть дело. Поэтому врачи оформляют бумаги в соответствии со стандартами, после чего заключение получает юридическую силу.
Анализ в лаборатории ДНК тестов ДТЛ
В нашей лаборатории работают лучшие специалисты. У них есть многолетний опыт сотрудничества с научно-исследовательскими лабораториями. Наши врачи постоянно повышают квалификацию, изучают новые методики, технологии, открытия. Они очень ответственно относятся к своим обязанностям.
Благодаря использованию современного высокотехнологичного оборудования, расшифровка генетического кода занимает 3-5 дней, независимо от того, какой нам предоставили образец: стандартный или нестандартный. Для бесплатной консультации всегда можно обратиться по телефону и получить ответы от наших специалистов. Мы гарантируем точность результата 99,9999 процента.
Можно ли выделить ДНК из молочных зубов?
В нашей практике самые популярные нестандартные образцы это ногти, ушная сера, биологические жидкости (кровь, сперма, женские выделения и слизистая из носа). Однако бывают запросы, связанные с выделением ДНК из или зубов, в том числе молочных. Например, многие родственники хранят первый молочный зубик, который выпал в детстве.
В 2011 году в Международном научном журнале судебно-медицинской экспертизы вышла статья “Молочные зубы как эталонный образец ДНК при идентификации жертв стихийных бедствий”.
стихийные бедствия (землетрясения, наводнения);
аварийные катастрофы (крушение самолетов, сход с рельсов поездов, пожары в зданиях);
терроризма (прямые атаки на значимые места и бомбардировки населенных пунктов, включая теракты смертников и размещение химического и биологического оружия).
Также криминалистическая идентификация необходима для гражданских или уголовных расследований.
Как проходит идентификация по ДНК
Чтобы выделить ДНК профиль, необходимо собрать образцы с тела или частей тела умершего (ногти, кости, мумифицированная мышечная ткань, зубы). В дальнейшем выделенный профиль сравнивают с эталонными образцами, это могут быть личные вещи (расчески, одежда, зубная щетка, бритва), молочные зубы, которые часто хранятся в семьях.
Или же сравнительный анализ может проводиться на основе профилей родственников (родственников первой и второй степени родства).
Детали исследования
Всего было получено 18 передних молочных зубов у 9 человек (срок хранения зубов от 2 до 18 лет). Каждый образец был обеззаражен и очищен от сторонних ДНК и ингибиторов ПЦР. После удаления эмали криогенное измельчение производили в морозильной камере, где зуб был измельчен до состояния порошка.
В качестве контрольных образцов были взяты мазки буккального эпителия у тех же 9 человек.
Полученные результаты количественного анализа ДНК были больше, чем 1 нг/1мл, что подтверждает все полиморфизмы набора.
Вывод исследования
Во всех 9 случаях этого исследования результаты, полученные из эталонных буккальных мазков соответствовали результатам, полученных из молочных зубов. Выделенное количество ДНК (от 1,33 и 154 нг/мл) показали, что молочные зубы, при условии щадящего хранения, даже по истечении 18 лет могут быть мощным инструментом для проведения генетического анализа.
ООО «Медикал Геномикс» Лицензия № ЛО-69-01-002086 от 06.10.2017
Юр. адрес: г. Тверь, ул. Желябова, 48
ООО «Лаб-Трейдинг», ИНН: 6950225035, ОГРН: 1186952017053, КПП:695001001
Юр. адрес: г. Тверь, ул. 1-Я За Линией Октябрьской Ж/Д, 2, оф. 22
ПЦР-диагностика
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).
Принцип ПЦР- исследования
Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?
Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.
Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.
В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.
Как это все происходит в лаборатории
Выделение ДНК
Элонгация
Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.
Детекция
Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:
Преимущества методики ПЦР
Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).
Области применения в медицине
В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.
Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:
Какие материалы необходимы для теста ДНК?
Абсолютно любое исследование предполагает наличие образцов. Так же и с ДНК тесты не могут проводиться без биологического материала исследуемого лица. Рассмотрим подробно, какой материал нужен для ДНК.
В начале генетики использовали только кровь. Эти ограничения накладывались технологиями и существующими методиками анализа. Кровь нужна была свежая и в достаточном количестве для выделения необходимого количеств ДНК. Это создавало некоторые проблемы и сильно ограничивало возможности.
После открытия в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом инновационного метода — полимеразной цепной реакции (ПЦР), генетика перешла на качественно новый уровень. Это изобретение позволило работать с микро количествами дезоксирибонуклеиновой кислоты. В процессе реакции ПЦР многократно увеличивается количество определенных участков ДНК. Иными словами, ПЦР позволяет из малого объема сделать большой.
Основные пробы, необходимые для проведения анализа ДНК.
Благодаря развитию науки генетики и прикладных ее аспектов, сейчас выбор образцов ДНК для анализа очень широк. Генетическая «память» собержится в каждой клетке организма, что облегчает задачи генетиков. Разберем основные, разобьем их по типам и проанализируем степень выделения.
Существует условно два вида генетического материала. Это стандартный образец и нестандартные образцы. Конечно, термин «нестандартный», применяемый ко второму виду, уместен лишь при возможности использования стандартного материала. Например, в случае исследования именно жидкой крови эта технология не может быть применена.
Стандартный образец.
Это соскоб буккального эпителия с внутренней стороны щеки. Иногда его называют «тест по слюне» или «ротовой мазок». Обычно для забора буккального эпителия используют медицинские ватные зонды или медицинские полимерные щетки.
Такой биологический материал очень удобно собирать даже в домашних условиях. Вместо зондов можно применять ватные палочки из аптеки.
Рассмотрим краткую инструкцию:
Если выполнять все в строгом соответствии с инструкцией, не возникнет необходимости перебора образцов.
Крайне запрещается:
Нарушение этих правил может привести к контаминации (смешению профилей днк), загрязнению или уничтожению ДНК плесенью.
Нестандартные образцы.
Это довольно обширный круг биологических материалов. По сути все образцы, кроме буккального эпителия можно считать нестандартными. В чем же их нестандартность?
Дело в том, что вероятность выделения чистой ДНК из таких материалов ниже, чем из мазка и существенно дороже. Генетикам приходится тратить дополнительные реактивы, проводить стадии очистки. Это все удорожает исследование и увеличивает время для получения результата.
К наиболее популярным стандартам относятся:
Для теста может подойти любой материал, содержащий ДНК.
Образцы для теста на отцовство
В зависимости от вида исследования могут быть применены разные типы образцов. Какой биоматериал необходим для определения отцовства?
При информационном установлении отцовства можно использовать любой материал. Анализ может быть выполнен анонимно с использованием ногтей, волос, бритвы т.д. Такой тест не будет иметь юридической силы.
Для судебно-генетической экспертизы подойдет либо буккальный эпителий, взятый по регламенту и при свидетелях, либо нестандарт, задокументированный в протоколе при свидетелях. Иначе суд скорее всего не примет результаты экспертизы.
С точки зрения точности результата нет никакой разницы из чего была выделена ДНК. Она одинаковая во всем теле.
Если есть возможность взять ротовой мазок, то лучше использовать этот образец. Так будет дешевле и быстрее. Какой образец использовать для исследования в конкретной ситуации, подскажут специалисты «ИнЛаб Генетикс» по бесплатному телефону горячей линии.
Выделение днк для чего нужно
При применении методик идентификации хемолитотрофных организмов с использованием разновидностей полимеразной цепной реакции особенно остро встаёт вопрос о методах выделения и очистки бактериальной хромосомной ДНК. Ещё более важным он становится при использовании разновидностей ПЦР, в ходе которых проводится количественный анализ (ПЦР в реальном времени и т.д.). Наличие нелизированных клеток вносит в той или иной мере существенные погрешности в результаты количественного анализа и в ряде случаев может привести к недостоверным результатам.
Некоторые методы выделения ДНК могут вносить искажение в результат количественного анализа за счёт неэффективного лизиса клеток, сорбции ДНК на частичках грунта, наличия в препарате ферментативных и других ингибиторов, а также потери ДНК или нарушения ее структуры. Кроме того, качество препарата оказывает влияние на достоверность анализа, основанного на методах прямого определения нуклеотидной последовательности (секвенирования) и клонирования, широко применяемых при изучении структуры сообществ [1, 2].
Существует множество способов воздействия на клетки с целью их разрушения и последующей очистки содержащихся в них нуклеиновых кислот: химический, физический и ферментативный. К самым распространенным физическим способам относятся обработка ультразвуком, нагревание, механическое перетирание и разрушение клеточной стенки методом замораживания/оттаивания [3]. Химические способы разрушения клеток основаны на лизирующей активности некоторых солей и детергентов. И, наконец, к третьему распространенному способу воздействий относятся ферментативные подходы, использующие активность протеолитических ферментов (лизоцима и протеиназы К). Следует отметить, что наиболее распространенные методы выделения ДНК практически всегда представляют собой комплексный подход, включающий несколько этапов пробоподготовки.
В связи с этим целью работы стала апробация нескольких способов выделения ДНК и выбор метода, наиболее подходящего для анализа накопительных культур сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов. Получаемая смесь нуклеиновых кислот должна быть репрезентативной и, по возможности, сохранять количественное соотношение копий геномов каждого вида, входящего в состав пробы. Выполнение последнего условия необходимо для проведения точного количественного анализа сообществ.
Основной проблемой, которая должна была быть учтена при выборе методики выделения бактериальной ДНК, является неоднородность свойств данных микроорганизмов, среди которых особенно следует выделить свойства их клеточных стенок. Как известно, лизис грамположительных бактерий и архей (сходных по строению клеточной стенки с грамположительными эубактериями) осуществить гораздо сложнее по сравнению с лизисом грамотрицательных бактерий. А поскольку среди исследуемых микроорганизмов присутствуют представители всех вышеупомянутых групп, остро встаёт задача выбора универсальной методики выделения ДНК.
Для выделения ДНК (РНК) из клеток их необходимо предварительно лизировать. Пробоподготовка проводится также для удаления из полученного материала ингибиторов Taq-полимеразы (белковых примесей и др.) и различных РНКаз. Обработка проб проводится в микроцентрифужных пробирках типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл. Время обработки в зависимости от метода доходит до 3–4 ч.
На данный момент существует целый ряд методов для выделения ДНК из клеток. Анализ методик выделения ДНК наиболее целесообразно проводить среди методов, используемых с этой целью в практике клинического молекулярно-биологического анализа, поскольку большинство этих методов имеют относительно универсальный характер.
Следует отметить также достаточно низкий уровень освещённости подобных методов в русскоязычной литературе. По-видимому, это связано с тем, что большинство лабораторий используют для выделения и очистки ДНК заводские наборы, при работе с которыми используются приписанные к ним протоколы.
Целью данной работы является анализ существующих методик выделения ДНК и выявление наиболее приемлемых из них для выделения хромосомного генетического материала из хемолитотрофных ацидофильных микроорганизмов, принадлежащих к родам Acidithiobacillus, Sulfobacillus и Ferroplasma.
Приведем небольшой обзор методов выделения ДНК, используемых в клинической и лабораторно-диагностической практике, и анализ возможностей их применения.
Метод выделения ДНК одношаговый с использованием «Tri reagent». Проба смешивается с 500 мкл 0,9 % раствора хлорида натрия и центрифугируется при 5000 об/мин в течение 10 мин дважды с заменой супернатанта 0,9 % раствором NaCl. Затем осадок обрабатывают лизирующим раствором – раствор «Tri reagent» фирмы Sigma (США) с добавлением детергентов (рН 8,0) и инкубируют при +95 °С в термостате или кипящей водяной бане в течение 10 мин. Далее центрифугируют для осаждения нелизируемых клеточных структур и капель жидкостей на стенках пробирки. Данный метод рекомендуется для выделения ДНК из клеток, культур клеток и монослойной ткани из цельной крови, плазмы или сыворотки.
Метод выделения ДНК путем термического лизиса в присутствии сорбента. Вместо лизирующего раствора для лизиса клеток применяется высокая температура. В пробу добавляют катиониты, которые связывают белки, и кипятят на водяной бане в течение 5–10 мин. Если в дальнейшем выделенная ДНК будет использована для классической ПЦР, а не для её разновидностей, и при наличии чистых культур, для выделения можно воспользоваться модифицированной методикой – с отсутствием сорбента. Культуральный материал ресуспендируют в 100 мкл ТЕ (10 мМ ТрисHCl ph8.0, 1мм ЭДТА). Затем кипятят на водяной бане в течение 3 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин. Супернатант можно использовать для ПЦР-амплификации. Основным плюсом этого метода являются его высокая скорость и относительная простота исполнения. А к наиболее значимым недостаткам следует отнести вероятность попадания в выделенный образец примесей, ингибирующих ПЦР.
Метод выделения ДНК с помощью фенольно-спиртовой депротеинизации получил широкое распространение, и его модификации используются в качестве основных способов экстракции ДНК. В пробирки вносят 0,9 мл лизирующего буферного раствора, 22 мл 0,2 М раствора ЭДТА, 2,6 г Тритона X 100 и 40 мкл суспензии сорбента, встряхивают на вортексе и прибавляют 50 мкл исследуемого материала. Встряхивают 5 с, оставляют при комнатной температуре на 15 мин, вновь встряхивают 5 с и центрифугируют 15 с при 12000 об/мин. Супернатант удаляют, осадок сорбента отмывают дважды, сначала отмывающим раствором, а затем 2 раза 70 % этанолом и один раз ацетоном (все промывающие жидкости вносят в пробирку в объеме 0,5 мл). Затем пробирки с открытыми колпачками прогревают в течение 10 мин при 56 °С в микротермостате. К высушенным осадкам добавляют 50–75 мкл элюирующего буфера. Пробирки закрывают крышками и недолго встряхивают на вортексе, инкубируют при 56 °С в течение 10 мин, вновь встряхивают на вортексе и центрифугируют 2 мин при 12000 об/мин. Супернатант содержит ДНК и РНК и пригоден для амплификации.
Выделение ДНК путем гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной экстракции. Метод применяется для выделения ДНК, клеточной мРНК, а также вирусных ДНК и РНК. В настоящее время он упрощен благодаря комбинации денатурирующего агента (гуанидинтиоцианата) и фенола в одном растворе. В пробирку «Эппендорф» помещают 3 мкл носителя нуклеиновых кислот. Затем добавляют 900 мкл денатурирующего раствора и через 15 мин – 200 мкл хлороформа. Центрифугируют 12000 об/мин в течение 5 мин. Полученный супернатант переносят в другую пробирку с 700 мкл изопропанола, оставляя растворы на 15 мин при комнатной температуре. Затем пробу центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин, удаляют супернатант и осадок обмывают 0,5 мл 70 % этанола. Центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин и удаляют супернатант. Высушивают полученный осадок, а затем растворяют в 30 мкл буфера для растворения. Оставляют на 15 мин при комнатной температуре, затем перемешивают и центрифугируют 5–10 с. Фирма «Sigma» (США) предложила вместо хлороформа, который является высокотоксичным веществом, использовать 1-бром-З-хлоропропан, не уступающий по своим свойствам, но значительно менее опасный.
Метод экстракции ДНК с использованием набора «DIAtomTM DNA Prep». Данный метод является одним из наиболее эффективных для выделения ДНК с минимальной продолжительностью экстрагирования (25 мин для 4–8 жидких проб), не уступающий, а в ряде случаев и превосходящий зарубежные аналоги и по своим характеристикам предназначенный для выделения ДНК из различных биологических материалов (жидкостей, мелкоизмельченных твердых материалов, пятен крови и т.д.), а также для быстрой очистки ДНК из клинических проб (цельной крови, плазмы, сыворотки, мочи, соскобов слизистой и т.д.).
Принцип действия набора «DIAtom™ DNA Prep» основан на использовании лизирующего агента с гуанидинтиоцианатом, который предназначен для разрушения клеток, а также денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на NucleoS™ сорбенте, затем легко отмывается от солей и белков спиртовым раствором. ДНК, элюированная из сорбента Экстра-Геном™ или чистой водой, может исследоваться различными методами, в том числе с участием разновидностей полимеразной цепной реакции.
Метод выделения ДНК с применением набора «ExtraGene™ DNA Prep». Метод предназначен для быстрого (не более одного часа) выделения ДНК из цельной крови, пятен крови или других биологический жидкостей, из клеточных суспензий. Метод не требует использования фенола с хлороформом и осаждения ДНК этиловым спиртом. Для выделения используется ExtraGene™ смола и протеиназа К. Принцип действия отечественного набора ExtraGene™ DNA основан на использовании смолы (смеси ионообменников) для обессоливания среды сорбции низкомолекулярных пептидов и хелатирования (маскировки) двухзарядных катионов металлов (Mg2+, Mn2+, Са2+ и т.д.) и применении протеиназы К для инактивации нуклеаз и других ингибиторов белковой природы. При этом ДНК остается в супернатанте растворенной и свободной, готовой к использованию непосредственно в амплификационных реакциях без дальнейшей очистки [4].
Метод сорбции на силикагеле предполагает лизис микроорганизмов в концентрированном растворе гуанидинтиоцианата, кроме этого обеспечивается сорбция ДНК или РНК на частицах силикагеля в суспензии. Далее после четырех промывок и центрифугирования суммарная нуклеиновая кислота элюируется с высушенного силикагеля водой или слабосолевым буфером.
Для оценки эффективности методов выделения ДНК из смешанных культур, а также для выбора наиболее удобной и универсальной методики нами были отобраны несколько комбинированных протоколов очистки ДНК основанных на различных типах воздействия на клеточную стенку бактерий. Были проанализированы методики, основанные на механическом (перетирание клеток с частицами SiO2) [5], ферментативном (обработка протеиназой К и лизоцимом) [6], химическом (обработка GuSCN [7] и CTAB) воздействии на клеточные стенки бактерий, а также применена комбинированная методика щелочного лизиса (KOH) в присутствии низкомолекулярного полимера (PEG-200). В выделение во всех случаях брали 500 мкл образца. Перед этапом лизиса пробы промывали фосфатным буфером (pH 1,8) два раза. После каждой промывки клетки и частицы грунта осаждали центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 минут.
При перетирании с частицами SiO2 осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора содержащего 20 % ДДС (100 мM NaCl, 500 мM Tris (pH 8,0), 20 % ДДС), к раствору добавляли 20 мкл раствора частиц SiO2 (0,005 г/л) производства «SigmaAldrich» (США) в ТЕ-буфере. Перемешивали в течение 5–10 мин. После сорбции ДНК частицы осаждали центрифугированием, супернатант удаляли. ДНК элюировали в 100 мкл воды при температуре 60 °C. Ферментативный способ лизиса заключался в ресуспендировании осадка в 500 мкл буфера (100 мM NaCl, 100 мM Tris, 1 мM цитрата натрия, 5 мM CaCl2, 25 мM ЭДТА, pH 8,0). К раствору добавляли 60 мкл лизоцима (0,1 г/л) «Fermentas» (Литва) и инкубировали при температуре 37 °С в течение 40 мин. Добавляли 10 мкл 20 % ДДС, 60 мкл протеиназы К (20 мг/мл) «Fermentas», инкубировали при 50 °С в течение 30 мин. При обработке CTAB осадок ресуспендировали в 500 мкл лизирующего буфера (0,2 М Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 М ЭДТА, 2 М NaCl, 2 %-ный СТАВ), инкубировали в течение 30 мин при температуре 65 °С. При обработке KOH осадок ресуспендировали в 500 мкл лизирующего буфера (10 % ПЭГ – 200, 20 мМ KOH), инкубировали 10 мин при температуре 98 °С.
Модификация методики с гуанидинтиоцианатом заключается в том, что образцы культур объёмом 500 мкл центрифугируют на 13000 об/мин в течение 5 минут, после чего «отмывают» осадок в фосфатном буфере PBS для удаления ингибирующих ПЦР примесей. После подобных процедур выделение ДНК следует производить по стандартному протоколу, несколько отличающемуся от стандартной методики.
К 200 мкл образца культуры добавляем 400 мкл лизирующего раствора (5,25 M GuSCN, 50 мM Tris, pH 6,4, 20 мM ЭДТА, 1,3 % тритон), перемешиваем и термостатируем при 65 °С 30 мин. Добавляем 400 мкл водонасыщенного фенола (pH 7,2), перемешиваем. Добавляем 400 мкл смеси хлороформа и 100 %-ного изоамилового спирта в соотношении 24:1, перемешиваем. Центрифугируем в течение 10 минут при 13000 об/мин. Верхнюю водную фазу переносим в новую пробирку, добавляем 800 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24:1, перемешиваем. Центрифугируем в течение 10 минут при 13000 об/мин. Верхнюю фазу переносим в новую пробирку, добавляем 400 мкл изопропанола, перемешиваем. Центрифугируем в течение 5 минут при 13000 об/мин. Удаляем надосадочную жидкость, добавляем 800 мкл 70 %-ного этанола, перемешиваем. Центрифугируем в течение 5 минут при 13000 об/мин. Удаляем надосадочную жидкость, осадок высушиваем в термостате при температуре 55 °С не более 10 минут. Растворяем осадок в 50 мкл ТЕ-буфера путём периодического перемешивания и нагрева при 55 °С.
После этапа лизиса проводили очистку от ингибиторов с помощью стандартной методики фенол-хлороформной экстракции [8]. После преципитации ДНК растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера.
Рассмотренные нами методики выделения и очистки хромосомной бактериальной ДНК являются относительно универсальными, а значит, могут быть использованы при работе с хемолитотрофными микроорганизмами. При экспериментальном подтверждении выбранные нами методы продемонстрировали значительные отличия в эффективности выделения нуклеиновых кислот из предоставленных накопительных культур. Это может объясняться и различной эффективностью очистки от ингибиторов, и комплексным составом исследованных образцов [9].
Наилучший результат получен для методики, основанной на лизирующей активности GuSCN. Сходный по эффективности результат был получен для ферментативной методики, однако в данном случае на результат оказали влияние остатки бактериальных нуклеиновых кислот, содержащиеся в реагентах, использованных при выделении ДНК. Использование ферментов при выделении ДНК приводит к значительному сдвигу кривой контроля выделения.
Показана низкая эффективность методик, основанных на лизирующей активности бромида цетилтриметиламмония (CTAB) и на физическом воздействии на клетки с помощью частиц SiO2. Для методики, основанной на лизирующей активности KOH, в присутствии PEG-200, получен средний результат, однако ее принципиальным недостатком является низкая степень очистки препарата ДНК от ингибиторов, в частности ионов железа, содержащихся в некоторых культуральных средах. В то же время этот метод показал лучший результат для проб, содержащих микроорганизмы, не окисляющие железо.
Полученные результаты позволяют рекомендовать для проведения молекулярного анализа структуры сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов методику, основанную на лизирующей активности GuSCN с последующей очисткой фенолом и хлороформом, поскольку данная методика является апробированной на культурах хемолитотрофных микроорганизмов, достаточно освещена в литературе и может осуществляться при помощи стандартных наборов для выделения ДНК. Данная методика может быть использована для самых различных разновидностей ПЦР, в том числе и для количественной real-time ПЦР [10]. Она может быть реализована при использовании набора «Проба-НК» производства НПО «ДНК-Технология». Однако из-за большого количества стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется высокая степень аккуратности, т.к. возможна перекрёстная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК [11].
К числу рекомендуемых следует отнести также метод выделения ДНК путем ферментативного лизиса. При эффективном апробировании данного метода на практике его можно отнести к числу пригодных и рекомендуемых для выделения хромосомной бактериальной ДНК хемолитотрофных микроорганизмов, принадлежащих к родам Acidithiobacillus, Sulfobacillus и Ferroplasma.