вирус днк что это
Не только ВИЧ. Как устроены вирусы?
Галина Вирясова
Сайт СПИД.ЦЕНТР немало рассказывает своим читателям о вирусе иммунодефицита человека, но как устроены остальные вирусы? Чтобы помочь увидеть общую картину, наши авторы подготовили небольшой гид по вирусам с объяснением, как они работают, размножаются и как работают противовирусные лекарства.
Одни вирусы способны интегрироваться в геном клетки-мишени и таким образом оставаться во всех дочерних клетках, которые будут в будущем получены после ее деления. К таким вирусам относятся гаммаретровирусы и лентивирусы. Другие делать этого не умеют (например, адено- и аденоассоциированные вирусы). Но для производства белков и репликации (размножения) все они используют клетку и ее синтетический аппарат.
Несмотря на некоторую «несамостоятельность» в размножении, вирусы способны наследовать генетические мутации и подвержены эволюционному отбору. Выживает сильнейший, а в случае вируса — самый устойчивый и заразный.
Как это работает?
Для того чтобы вирус мог проникнуть в клетку, белки его оболочки должны связаться с мембранными белками клетки-мишени. Важно отметить, что проникает вирус только в те клетки, которые могут в дальнейшем помочь его репликации. Вирус ВИЧ живет в клетках иммунной системы, вирус гепатита С — в клетках печени. Есть особые вирусы, которые поражают только растения или даже только бактерии.
В целом у вирусов существуют разные стратегии доставки вирусного материала в клетку. Какие-то вирусы размножаются в ее цитоплазме, а какие-то — в ядре. Некоторые умеют «впрыскивать» свою генетическую информацию прямо через мембрану, когда сам капсид остается снаружи.
Объединяет их одно: после того как вирусная информация доставлена в клетку, та, «забывая» о своей изначальной функции, начинает заниматься в первую очередь репликацией вируса. Клетка производит матричную РНК (мРНК), с которой затем синтезируются вирусные белки и копируется геном, и сама собирает новую вирусную частицу.
В большинстве случаев вирус убивает клетку, чтобы выйти наружу и приступить к поиску новой «жертвы». Но иногда этого не происходит: некоторые вирусы, в том числе ВИЧ, могут отделяться от клетки, обзаведясь собственной оболочкой и оставив клетку в живых, чтобы та продолжила производить новые вирусные частицы.
Содержащие неактивный вирус и оставшиеся в живых клетки иногда сохраняют возможность нормального функционирования. В этом случае клетки могут быть заражены, но вирус проявит себя спустя длительный период времени. Так устроен герпес.
В зависимости от того, каким типом нуклеиновой кислоты представлен генетический материал, выделяют ДНК-содержащие вирусы и РНК-содержащие вирусы. И тут стоит остановиться на классификации.
Типы вирусов. Коротко о главном
Современная типология вирусов содержит 7 классов и была предложена Дэвидом Балтимором еще в 1971 году. С тех пор, впрочем, она была уточнена и расширена, в том числе советскими учеными. И выглядит в настоящее время таким образом:
Вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК
Описание
Для репликации вирусу необходимо попасть в ядро клетки-мишени и воспользоваться ее ДНК-полимеразой. Иногда вирус вызывает незапланированное деление самое клетки, то есть становится онкогенным. Эти вирусы хорошо изучены.
Пример: Вирус герпеса, адено- и папилломавирусы
Вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК
Описание
Попадая в ядро клетки, вирусы образуют двухцепочечную ДНК, после чего реплицируются так же, как вирусы класса I.
Пример: Парво- и цирковирусы
Вирусы, в которых РНК способна к репликации (редупликации)
Описание
Вирусы этого класса могут размножаться в цитоплазме клетки, им не нужна молекула ДНК. Каждый ген, находящийся в РНК вируса, кодирует только один вирусный белок.
Пример: Бирна- и реовирусы
Вирусы, содержащие одноцепочечную (+) РНК
Описание
Из геномной (+) РНК на рибосомах хозяина создаются вирусные белки. В одном фрагменте РНК могут быть закодированы разные белки, что увеличивает сложность вируса без удлинения генов.
Пример: Пикорнавирусы (полиомиелит, гепатит А) и коронавирусы
Вирусы, содержащие одноцепочечную (–) РНК
Описание
(–) РНК этих вирусов предварительно должна быть транскрибирована в (+) РНК вирусными РНК-полимеразами, после чего может начаться синтез вирусных белков. Вирусы этого класса делятся еще на две группы, в зависимости от их генома и места его репликации (цитоплазма или ядро).
Пример: Филовирусы, аренавирусы (геморрагическая лихорадка Ласса), ортомиксовирусы (вирусы гриппа) и так далее.
Вирусы, содержащие одноцепочечную (+) РНК, реплицирующиеся через стадию ДНК
Описание
Такие вирусы используют фермент обратную транскриптазу для превращения (+) РНК в ДНК, которая встраивается в геном хозяина ферментом интегразой. Дальнейшая репликация происходит при помощи полимераз клетки хозяина.
Пример: Ретровирусы (в том числе ВИЧ)
Вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК, реплицирующиеся через стадию одноцепочечной РНК
Описание
Молекула ДНК замкнута в кольцо и является матрицей для синтеза мРНК и дополнительных молекул РНК, которые используются при репликации вирусного генома обратными транскриптазами.
Пример: Колимовирусы (вызывают инфекции растений) и гепаднавирусы (например, гепатит В)
Вакцинация и лечение
Как правило, организмы умеют бороться с паразитирующими на них вирусами. На примере млекопитающих и человека мы обычно говорим о главном инструменте — врожденном иммунитете.
Впрочем, наиболее эффективен этот вид защиты в отношении бактериальных инфекций и не может обеспечить продолжительную и надежную защиту, особенно от инфекций вирусных.
Именно поэтому огромное значение имеет приобретенный иммунитет, в результате которого клетки иммунной системы обучаются вырабатывать специфические к вирусу антитела, способные уничтожать как саму вирусную частицу, так и зараженные ею клетки.
Еще одна врожденная система борьбы с вирусными инфекциями — внутриклеточная. Как правило, клетка способна распознать чужеродную РНК в своей цитоплазме, куда ее сперва и доставляют многие вирусы, и имеет специальные комплексы для ее деградации. Но часть вирусов научились обходить и эту ловушку. К примеру, ротавирусы, которые даже внутри клетки сохраняют капсид с геномной РНК.
С приобретенным иммунитетом тоже не все гладко. Некоторым вирусам, например, ВИЧ, удается избежать иммунного ответа. Другим, например нейротропным вирусам, — уклониться от него, выбрав безопасную среду обитания: они распространяются среди клеток нервной системы, где их не может «достать» иммунная система. Самый известный из таких вирусов — вирус бешенства, который способен проникать в нейроны.
Миссия: уничтожить
Основная сложность в лечении вирусных заболеваний заключается в том, что они используют естественные функции клеток-мишеней для своего размножения, поэтому ученым зачастую оказывается не так-то просто придумать препарат, который будет токсичен для вируса и безопасен для самой клетки. Если такой безопасности достичь не удастся, лекарство будет иметь слишком много побочных эффектов, повреждающих сам организм, что окажется нецелесообразно для использования.
По принципу действия противовирусные препараты подразделяются на две группы: стимулирующие иммунную систему атаковать вирусы (например, за счет индукции синтеза белков-интерферонов) и атакующие вирусы напрямую. Препараты второй группы различаются по этапу жизненного цикла вируса, на котором они активны: это препараты, препятствующие проникновению вируса в клетку, препятствующие размножению вируса внутри клетки и препятствующие выходу копий вируса из клетки.
Чтобы помешать проникновению вируса, препарат должен заблокировать рецептор на клетке, с которым связывается вирусная частица. Так работает, например, ибализумаб — зарегистрированный в США новый препарат против ВИЧ, о котором мы недавно писали.
Такие противовирусные препараты, как уже давно известный ацикловир (им лечат инфекции, вызванные простым вирусом герпеса) или ламивудин (активен против ВИЧ и гепатита В), представляют собой синтетические аналоги нуклеозидов — «букв», из которых состоят нуклеиновые кислоты. Если эти модифицированные, неправильные нуклеозиды попадают в клетку, вирусный геном, в который они оказались встроены, становится непригоден для дальнейшего распространения вируса.
Еще один класс противовирусных препаратов блокирует ферменты, необходимые для создания и модификаций белков вируса. Такие лекарства называют протеазными ингибиторами.
Вместо заключения: а могут ли вирусы приносить пользу?
Безусловно, да. Несмотря на то, что вирусы ассоциируются у большинства людей с однозначным вредом, они могут приносить и пользу — если речь идет о так называемых вирусных векторах и терапевтических подходах на их основе.
Исследователи давно научились помещать в белковую оболочку вируса интересующие их нуклеиновые кислоты, чтобы доставлять нужный ген в клетки, а также убирать те гены, которые делают вирус опасным для организма.
Это позволило сделать возможной генную терапию, помогающую бороться с заболеваниями, вызванными известными генетическими мутациями. Создание вирусных векторов — достаточно непростая задача, к тому же ограниченная свойствами самих вирусных частиц: количеством помещающейся генетической информации, местом ее вставки, стабильностью. Кроме того, вирусный вектор, используемый в медицине, не должен вызывать иммунного ответа или критично влиять на жизнедеятельность клетки. Тем не менее эти сложности решаются, поэтому уже одобрен ряд вполне успешных и безопасных генных терапий. А в качестве основы для вирусных векторов чаще всего используются ретро-, ленти-, адено- и аденоассоциированные вирусы.
Убить невидимого убийцу. Все о вирусах и методах борьбы с ними
Алевтина Боголюбова-Кузнецова СПИД.ЦЕНТР
Вирусы у всех на слуху. С одними мы неизбежно сталкиваемся лично, например, с вирусами гриппа или теми, что вызывают простуду. Другие будоражат медицинское сообщество, наводняют новости и становятся зловещими прообразами для популярной литературы и кино.
И это неудивительно хотя бы потому, что вирусы — штука довольно непонятная. Неясно даже, считать их живыми или нет. С одной стороны, это просто хрупкий набор молекул, который не может существовать автономно, без живой клетки. Он не производит и не накапливает энергии, а также не поддерживает постоянства внутренней среды — ее попросту нет. Но когда вирус попадает в клетку, он проходит жизненный цикл, копирует себя и эволюционирует. Невидимое глазу нечто существует в огромном количестве, постоянно меняется, переходит от одних хозяев к другим и причиняет страдания разной степени тяжести всему человечеству.
Как устроены вирусы?
Вирусная частица, или вирион, — это нуклеиновая кислота (ДНК или РНК) в обертке из белков. В некоторых случаях она покрыта дополнительным слоем липидов, «украденных» у клетки-хозяина. У вирусов есть своя классификация: царства, семейства и прочие таксоны (группы), за списком которых следит Международный комитет по таксономии вирусов. Самый большой таксон — реалм. Сейчас ученые выделяют четыре реалма, из которых три — ДНК-содержащие вирусы. К ним относятся, например, вирусы оспы, герпеса и папилломавирусы.
РНК-содержащие вирусы можно разделить на собственно РНК-вирусы и ретровирусы. Первые — это вирусы гриппа, бешенства, гепатита С, а также коронавирусы и вирус Эбола. Они содержат РНК и используют для размножения РНК-зависимую РНК-полимеразу, с ее помощью на исходной молекуле РНК сразу синтезируется новая. А к ретровирусам относится, например, ВИЧ. Он содержит РНК, но в ходе жизненного цикла она превращается в ДНК и встраивается в геном клетки-хозяина. После чего новая РНК синтезируется уже на основе молекулы ДНК — то есть так же, как у нас.
Как с ними бороться?
Можно выделить три стратегии борьбы с вирусами. Первая — «пожар проще предотвратить, чем потушить». Защититься от заражения можно по-разному, например, избегать незащищенного секса или контакта с зараженной кровью. Более изощренный способ — контроль природных резервуаров вируса: осушение болот (чтобы предотвратить вспышки желтой лихорадки), карантин, вакцинация или отстрел животных.
Еще одна стратегия — активная и пассивная иммунопрофилактика. Активная — это простая и всем знакомая вакцинация. Человеку вводят неактивную форму вируса или его кусочек, в организме срабатывает иммунный ответ и синтезируются антитела, которые защитят человека в будущем, если он когда-нибудь встретится с настоящим живым вирусом. Но вакцину не всегда можно создать, да и уже существующие порой не работают на все сто. Так, вакцина от гриппа защищает только от нескольких — самых распространенных в текущем сезоне — штаммов (видов) вируса. Пассивная иммунопрофилактика — это введение готовых антител тем, кто уже встретился с вирусом или с большой вероятностью сделает это. Такие лекарства существуют для респираторно-синцитиального вируса (рекомендованы недоношенным младенцам) и ветряной оспы (для людей с подавленным иммунитетом).
И, наконец, последняя стратегия на случай, если ничто не помогло и человек заболел, — антивирусные препараты. Их развитие подстегивали научный прогресс и насущные проблемы. Чтобы придумать противовирусный препарат, нужно сначала изучить вирус и его жизненный цикл и выбрать возможные мишени для атаки. Причем такие, чтобы они как можно сильнее отличались от человеческих аналогов. Иначе лекарство будет бороться и с вирусами, и с невинными человеческими клетками, вызывая сильные побочные эффекты.
Первые клеточные культуры, в которых можно было имитировать взаимодействие вируса с хозяином, появились в 1950-х годах. До этого удобных моделей in vitro (в пробирке) не существовало, и изучение вирусов было затруднено. Уже в 1963 году появился первый антивирусный препарат — идоксуридин. Это был нуклеозидный аналог дезоксиуридина — одного из четырех «кирпичиков» молекулы ДНК. Препарат до сих пор используется при лечении герпеса.
В 80-е произошло другое громкое открытие — вирус иммунодефицита человека. Это породило шквал научных работ, посвященных разработке новых противовирусных лекарств. К тому времени связанный с ним СПИД уже распространился по миру, а в США началась эпидемия.
Какие бывают антивирусные препараты?
Их можно разделить на 13 групп, причем к шести относятся различные лекарства против ВИЧ. Это ингибиторы входа вируса в клетку, вирусных ферментов интегразы и протеазы, а также три вида ингибиторов вирусного фермента обратной транскриптазы, или ревертазы. Все они действуют на разные этапы жизненного цикла вируса:
1. Проникновение в клетку
Это первое, что должен сделать вирус, попав в организм. То, какую клетку он поразит, определяется рецептором на ее поверхности. У ВИЧ это рецептор CD4, который есть у Т-хелперов, макрофагов, а также некоторых других видов клеток. Кроме него в связывании вируса и его проникновении участвуют: рецепторы CXCR4 и CCR5 со стороны клетки и поверхностные гликопротеины gp120 и gp41 — со стороны вируса.
Сейчас FDA (американское Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) одобряет четыре лекарства, работающие на этой стадии. Каждый связывается с каким-то из участников процесса и мешает его работе. Например, к этой группе принадлежит самый новый препарат против ВИЧ — фостемсавир, его одобрили в США в июле 2020 года. В организме он превращается в активную форму темсавир, соединяется с вирусным гликопротеином gp120 и мешает ему связаться с клеточным рецептором CD4. Другой препарат — ибализумаб — связывается с самим CD4, причем так, что рецептор не может участвовать в проникновении вируса, но выполняет свою нормальную иммунную функцию — связывает и узнает антигены на поверхности антигенпрезентирующих клеток.
Подобные препараты также используются для лечения респираторно-синцитиального вируса, вирусов ветряной оспы и простого герпеса. Они тоже действуют на вирусные гликопротеины и их связывание с клеточными рецепторами. К этой же группе можно отнести препараты для пассивной иммунопрофилактики антителами.
2. Подготовка к размножению, часть 1
Когда вирус попал в клетку, он должен в ней размножиться, то есть создать копии себя, используя ресурсы самой клетки. Так как ВИЧ — ретровирус, его генетический материал — РНК, которая должна достроиться до двухцепочечной ДНК и встроиться в ДНК клетки. Процесс достраивания называется обратной транскрипцией, и для него необходим вирусный фермент обратная транскриптаза, ее еще называют ревертазой. Это самая популярная мишень препаратов против ВИЧ, которые делятся на две группы: нуклеозидные и ненуклеозидные.
3. Подготовка к размножению, часть 2
Чтобы наконец размножиться, ВИЧ, уже в виде молекулы ДНК, необходимо встроиться в геном клетки-хозяина. В этом участвует другой вирусный фермент — интеграза. Ее ингибируют несколько одобренных лекарств, причем они часто используются вместе с другим препаратом — кобицистатом. Он никак не действует на вирус, но ингибирует некоторые ферменты печени и увеличивает биодоступность самих антивирусных препаратов.
Попав в геном, вирус может запустить транскрипцию и синтезировать новые РНК и белки. А может и «заснуть». Именно поэтому ВИЧ почти нельзя вылечить: всегда останутся клетки со «спящим» вирусом, который себя не проявляет, а значит, не может быть мишенью для атаки. Активация вируса связана с активацией клетки. Так как ВИЧ инфицирует в основном иммунные клетки, именно те из них, что борются с инфекцией, и становятся его жертвой.
4. Созревание
Белки ВИЧ синтезируются в виде длинных полипротеинов, которые нужно «нарезать», чтобы получить зрелые формы. Для этого необходим вирусный фермент протеаза. Это — вторая по популярности мишень антивирусных препаратов. Большинство из них — белковые аналоги вирусного полипептида. Они ингибируют работу фермента, и зрелые вирусные белки и новые вирусные частицы не образуются. Подобно ингибиторам обратной транскриптазы, к препаратам из этой группы тоже очень быстро развивается резистентность. И, как и с ингибиторами вирусной интегразы, с ними часто используется кобицистат.
Препараты ингибирования вирусной протеазы также существуют для лечения вируса гепатита С. Несмотря на большие отличия в структуре и способе репликации, белки этого вируса тоже синтезируются в незрелой форме, которую нужно «нарезать».
Другие препараты
Есть три группы антивирусных препаратов, которые мы еще не упоминали. Во-первых, это ингибиторы белков NS5A и NS5B вируса гепатита С, которые играют важную роль в репликации РНК вируса. Во-вторых, лекарства против вируса гриппа: три ингибитора вирусного белка нейраминидазы и один ингибитор РНК-полимеразы вируса. И, наконец, сборная солянка препаратов, которые не действуют прицельно на вирусные компоненты. Это интерфероны, а также иммуностимуляторы и ингибиторы митоза клеток.
Первые заслуживают особого внимания из-за обилия отечественных лекарств против гриппа и простуды на их основе. FDA одобряет инъекции (!) интерферонов только для лечения гепатита B и С, причем на практике они используются очень осторожно из-за серьезных побочных эффектов. Отечественные противовирусные препараты с интерферонами, которые выпускаются в форме мазей, спреев и суппозиториев, вряд ли работают. И слава богу. Иммуностимуляторы и ингибиторы митоза клеток выпускаются в виде мазей и используются для лечения генитальных бородавок, то есть папилломавируса человека.
Наука не стоит на месте, и разработка противовирусных препаратов продолжается, подстегиваемая новыми вирусами, эпидемиями, а также развитием резистентности к существующим лекарствам. Но по-прежнему самыми изученными и многочисленными препаратами остаются ингибиторы вирусных обратной транскриптазы или ДНК-полимеразы и протеазы. Для разработки других стратегий борьбы ученым еще предстоит изучить детали работы вирусов — как давно известных, так и совершенно новых.
Да, вирусы остаются источником зловещих идей в популярной культуре. Но существующих препаратов и методов уже достаточно, чтобы мы могли избежать заражения, быстро вылечиться или свести негативные последствия болезни к нулю.
Как вирусы обманывают человека?
Метафорическая зарисовка. Представители различных генетических вариантов SARS-CoV-2 собрались за круглым столом и обсуждают план захвата мира. Рисунок в полном размере.
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Вирусы умеют не только размножаться внутри клеток хозяина, но и прятаться от его иммунитета. Способов избежать фатальных встреч с оборонными силами организма существует множество, но один из самых хитрых (и потому особенно интересных) механизмов демонстрируют вирусы с измененными генетическими последовательностями. Эта статья расскажет, что такое генотипы и генетические варианты вирусов и почему так важно о них знать.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа опубликована в номинации «Вирусы и микроорганизмы» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Зачем нам знать о генетических вариантах вирусов?
Новости о коронавирусе на протяжении всего 2020 года оставались самыми читаемыми, а количество научных публикаций о SARS-CoV-2 почти в пять раз превысило число статей по другой «громкой» теме — системам CRISPR/Cas: по данным PubMed их уже больше 60 тысяч! И здесь важнее следить не столько за драматической статистикой заражений и исходов, сколько за потенциалом и способностями возбудителя. Ведь вирусы умеют мутировать и порождать таким образом новые генетические варианты [1].
Генетические варианты вируса — это геномы какого-то вида (или штамма) вируса, отличающиеся друг от друга по последовательности нуклеотидов, и эти отличия могут обусловливать появление новых штаммов. «Генотип», «субтип», «генетический вариант» — термины, отражающие степень геномных различий (в порядке убывания).
По мере накопления знаний по этой теме опасения ученых лишь крепли: мутации могут влиять как на вирулентность, так и на тяжесть протекания заболевания, развитие лекарственной устойчивости и вероятность повторного заражения [2].
У SARS-CoV-2 весной 2020 года выделяли 3 генотипа: A, B и C [1]. Но сейчас особое внимание обращают на некоторые генетические варианты этого вируса и их географическое распределение (рис. 1) [3]. Известно, что даже самое маленькое изменение в генетическом материале возбудителя способно сильно сказаться на протекании либо распространении заболевания. На что же могли повлиять мутации в геноме SARS-CoV-2?
Рисунок 1а. Схематическое изображение эволюции SARS-CoV-2
Рисунок 1б. Карта распространения генетических вариантов SARS-CoV-2
Например, единственная мутация в гене поверхностного белка (spike-белка), вызвавшая замену его 614-й аминокислоты — D614G, — способствовала распространению SARS-CoV-2 по миру [4], [5].
Другая мутация, C14408T, в последовательности, кодирующей вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), потенциально способна влиять на развитие лекарственной устойчивости [6], [7]. Но самым поразительным можно считать случай, когда у пациента один генетический вариант SARS-CoV-2 заместился другим [8]. Дело в том, что наша иммунная система выстраивает защиту, по сути, от определенного вирусного генотипа. Если же вирус меняется, организм, встречавшийся с его предшествующим вариантом, новый может и не узнать.
Однако можно чуть-чуть успокоиться: мутации SARS-CoV-2 хоть и устроили хорошую суматоху, но так и не показали пока явной клинической значимости — в отличие от изменений ряда других вирусов. О них и пойдет речь дальше.
Вирусы гепатитов и компания
Гепатиты
В 2020 году Нобелевскую премию по физиологии или медицине вручили за открытие возбудителя одного из гепатитов — вируса гепатита С (ВГС, HCV) [9]. Болезнь может протекать без видимых симптомов, но при этом вирус сильно поражает печень. В крайних случаях развивается цирроз или даже рак печени [10]. К счастью, уже есть эффективные средства от гепатита С: по словам нобелевского лауреата Харви Олтера, противовирусные препараты прямого действия позволяют излечивать 95–98% пациентов [9]. Так в чем же подвох?
Интересно, что ВГС генотипов 1 и 4 обычно хуже поддаются терапии и требуют более продолжительного лечения, чем 2 и 3 [12].
| Генотипы ВГС | Субтипы |
|---|---|
| Генотип 1 | 1a, 1b |
| Генотип 2 | 2a, 2b, 2c, 2d |
| Генотип 3 | 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f |
| Генотип 4 | 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j |
| Генотип 5 | 5a |
| Генотип 6 | 6a |
| Генотип 7 |
При этом из-за высокой генетической вариативности, то есть больших различий между вирусными генотипами (до 30–35%), против ВГС не получается создать эффективную вакцину. Проблема усугубляется тем, что для тестирования прототипов вакцин нужны небольшие модельные животные, а получить мышей, способных одновременно болеть гепатитом С и имитировать человеческий иммунный ответ на инфекцию, очень трудно. И наконец, для изучения вируса in vitro нужно нарабатывать заразные частицы ВГС, а способные на это клеточные культуры появились лишь недавно [14].
Секвенирование вирусного генома показало, что в России циркулирует рекомбинантный вариант ВГС (RF2k/1b), генетически сходный с генотипами 1 и 2 одновременно. Из-за такой маскировки детекция этого генотипа затруднительна, а значит, и лечение бывает менее эффективным [15].
Итак, чтобы эффективно справиться с гепатитом С, нужно определить генотип его возбудителя. Не менее важно знать и генотип вируса, вызывающего другой гепатит — гепатит B. Да, от ВГВ (HBV) существует прививка [16]. Но! Есть основания считать, что генотипы ВГВ, несмотря на относительно небольшую вариативность (около 8% генома), по-разному влияют на тяжесть заболевания [17], [18].
Стоит, однако, учитывать, что результаты исследований связи вирусных генотипов с особенностями течения болезни весьма противоречивы. Чаще всего это связано с недостаточным размером изученных выборок, что, в свою очередь, обусловлено сложностями массового генотипирования. Из-за этого, например, на Тайване развитие гепатоцеллюлярной карциномы связывают с ВГВ генотипа В, а в Японии и КНР — с ВГВ генотипа С [19]. Тем не менее некоторые авторы приходят к выводу, что генотип ВГВ вообще не имеет большого клинического значения [20].
Хоть пока и нет общих рекомендаций проводить генотипирование ВГВ, ряд ученых призывает сделать его обязательным, поскольку пангенотипной терапии в случае гепатита В не разработано, а эффективность лекарств порой разнится в зависимости от генотипа.
Детекция генотипа вируса может стать хорошим подспорьем для врачей как минимум в двух направлениях: в определении вероятности развития той или иной формы болезни у конкретного пациента и в персонализации лечения. Однако подобных исследований крайне мало, можно даже сказать, что это поле еще совсем не пахано.
Денге
Мы уже заметили, что при разработке вакцин необходимо знать и учитывать разнообразие генотипов вируса. В этом отношении яркими примерами могут служить подходы к производству вакцин от гриппа и менее распространенной болезни — лихорадки денге, о возбудителе которой мы сейчас и расскажем [21].
Рисунок 2. Географическое распределение эндемичных по вирусу денге районов в 2011 году
У вируса денге выделяют четыре серотипа, то есть четыре группы вирусов с общей антигенной структурой. Генотипов у этого возбудителя больше, соответственно, и отслеживать их сложнее. Увы, но знания серотипа порой недостаточно для качественной вакцинации. Например, низкую эффективность одной из проходивших клинические исследования вакцин против серотипа 2 можно объяснить большой вариативностью составляющих его генотипов [22].
Существует мнение, что если эффективность вакцин против денге в новых клинических исследованиях останется низкой, при создании вакцинных препаратов необходимо будет отталкиваться именно от результатов генотипирования [21]. Это нужно и для исключения возможного антителозависимого усиления инфекции в случае, если вакцина будет защищать не от всех серотипов/генотипов, с которыми может встретиться отдельный организм.
Примечание
Антителозависимое усиление инфекции (ADE, antibody-dependent enhancement) — феномен, при котором связывание вируса с cубоптимальными нейтрализующими или не нейтрализующими антителами способствует его проникновению в иммунные клетки с последующей репликацией в них. Из-за ADE непроверенные вакцины могут быть очень опасными: при встрече с инфекцией вместо обеспечения защиты некоторые из них способны утяжелять течение заболевания [23].
Подводя итог, можно сказать, что знание генотипов вирусов необходимо для отслеживания распространения заболеваний по миру, для их лечения, а также для получения эффективных вакцин. К сожалению, пока генотип-специфичная борьба с инфекциями сильно ограничивается в том числе и недостатком информации о вирусных штаммах.
Но как вообще появляется это штаммовое разнообразие?
Вирусная хитрость: механизмы изменения геномов
Вирусы способны изменять свои свойства внутри клеток хозяев и в результате становиться заразнее и опаснее. Впрочем, не стоит пугаться. Обычно вирусная эволюция протекает в сторону снижения летальности, поскольку вирусу, который не убивает своего носителя и почти не вызывает симптомов, намного проще распространиться в популяции. Хоть геномы вирусов и изменяются с довольно высокой частотой, на деле мутации чаще оказываются нейтральными, не влекущими заметных последствий для вируса и его хозяина. Очень немногие из них действительно вносят вклад в дальнейшую эволюцию [24].
В основе способности вирусов к изменениям лежат мутации и/или обмен генетическим материалом между разными вирусами, результаты которых закрепляются или не закрепляются давлением естественного отбора.
Мутация — это изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома, нередко приводящее к изменениям структуры и/или функций организма или вируса. Мутации могут возникать из-за ошибок работы ферментов, создающих копии геномов, или под действием среды.
Когда одну и ту же клетку заражает два родственных вируса, могут образовываться гибридные вирусы, содержащие измененный по сравнению с родительскими формами генетический материал. Этот процесс называют рекомбинацией или реассортацией, если у вирусов сегментированный геном (в частицу он упаковывается отдельными сегментами типа мини-хромосом) [25].
Для справки
До введения термина «реассортация» в научный обиход рекомбинацией называли любой обмен генами, включая и те процессы, которые сейчас со знанием дела именуют реассортацией [25].
Реассортация очень напоминает появление детей у родителей: когда два разных вириона попадают в одну клетку и приступают к размножению, они могут обменяться частями геномов (рис. 3). В результате получится новая вариация (штамм) вируса, которая может значительно отличаться от своих предков [25]. Такие вирусы порой становятся неузнаваемыми для иммунной системы и распространяются, вызывая эпидемии и пандемии. Этот сценарий характерен, например, для вирусов гриппа. Некоторые исследователи винят в пандемии той же «испанки» именно вирусную реассортацию [26].
Рисунок 3. Реассортация вирусов, которая приводит к появлению штамма с измененным генетическим материалом
Благодаря мутациям и обмену генетическим материалом вирус может даже менять своего хозяина. Так SARS-CoV-1 от летучих мышей перешел в семейство виверровых (к мусангам и циветам), а затем и к людям. В начале 2000-х этот вирус вызвал эпидемию, охватившую 29 стран [28].
Новые генотипы могут возникать и в ходе лабораторных пассажей, когда вирусом последовательно заражают нескольких животных, выделяя из них новую чистую культуру возбудителя [29]. Такая процедура нужна, в частности, для тестирования противовирусных лекарств и вакцин.
Свойства вируса во время пассажей меняются ступенчато. В первых пассажах в основном обнаруживают вирионы, изменившие какой-то один генетический признак. Но с увеличением числа пассажей у подавляющего большинства вирусных частиц наблюдают изменение многих генетических признаков.
Кроме рекомбинации и мутаций, изменчивость вируса может быть обусловлена влиянием хозяина (host-controlled variation). Такие модификации не затрагивают генетический материал вируса и встречаются, например, у ДНК-содержащих бактериофагов, вирусов гриппа и Сендай. Клетка может влиять на характер синтезируемых в ней вирусных компонентов. Или в вирусную частицу могут попадать хозяйские белки и липиды. Поэтому при смене клетки-хозяина в структуре оболочки вириона меняются и антигены, с помощью которых организм узнает вирус.
Итак, образование новых вирусных генотипов — совершенно обычное явление, основанное на стандартных эволюционных процессах. Однако как нам эти генотипы детектировать?
Как выявляют генотипы вирусов?
Теперь, когда мы знаем, как возникают вирусные генотипы и как от генетического варианта возбудителя могут зависеть течение, распространение и лечение заболевания, перейдем к обсуждению лабораторных методов. Они позволяют нам определять, вирус какого генотипа вызвал болезнь у конкретного пациента. Рассмотрим методы детекции генотипов на примере вируса ВГС. В настоящее время лабораторные анализы, используемые в схемах диагностики и лечения гепатита C, представлены серологическими тестами для обнаружения антител к ВГС, молекулярными тестами для выявления и количественной оценки РНК ВГС, а также методами генотипирования возбудителя [30].
При первоначальной диагностике гепатита C учитывают симптоматику и уровни ферментов печени (особенно аланинаминотрансферазы, АЛТ) в крови. У пациентов с подозрением на гепатит C иммуноферментным анализом (EIA) [31] или хемилюминесцентным иммуноанализом (CIA) выявляют антитела к ВГС. В популяциях с низким риском инфицирования этим вирусом отрицательного результата EIA или CIA достаточно, чтобы исключить заражение гепатитом C. Но важно помнить, что у пациентов с ВИЧ или последней стадией почечной недостаточности серологические тесты на антитела к ВГС могут давать ложноотрицательные результаты. Если тест выявил антитела или допускается возможность ложноотрицательного результата, в организме пациента должны искать РНК самогό вируса.
Определение статуса инфекции ВГС, решение о лечении и мониторинг ответа на него зависят от трех важных факторов: обнаружения РНК вируса гепатита С, ее количества и вирусного генотипа. Для оценки всех этих параметров есть несколько коммерческих тест-систем. Они различаются по диапазону обнаружения, чувствительности, специфичности, стоимости и сложности использования.
Выявление РНК вируса гепатита С основано на принципе амплификации нуклеиновых кислот [32], причем применяют здесь комбинацию разновидностей полимеразной цепной реакции (ПЦР): качественную ПЦР, опосредованную транскрипцией амплификацию (ТМА) и количественную ПЦР в реальном времени.
Генотипирование ВГС необходимо для назначения оптимальной схемы лечения. Генотип этого вируса можно определить несколькими методами, нацеленными на гены вирусных белков (E1, NS4 и NS5) и на 5′-нетранслируемую область (5′-UTR) генома ВГС. Они включают простую ПЦР, гибридизацию с генотип-специфичными зондами и ПЦР в реальном времени. Однако для более точного определения вирусного генотипа следует прибегать к методам секвенирования нового поколения (NGS) [33].
Наш проект HaploSense
Как мы уже поняли, определять генотипы сложно, поскольку практически нет быстрых и доступных тестов. Наша команда студентов и аспирантов под названием Moscow 2020 решила изменить эту ситуацию.
На международном конкурсе iGEM в этом году мы представили проект детектора генотипов вируса гепатита С. В основе детекции лежит система CRISPR-Cas, с которой многие читатели уже знакомы [34], [35], а принцип работы напоминает популярные методы детекции SHERLOCK (Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing) и DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) [35]. Но есть и важные отличия, о которых сейчас расскажем.
В своей тест-системе мы использовали самый маленький из открытых к этому моменту Cas-белков — CasX (или Cas12e) из Deltaproteobacteria: он состоит из 980 аминокислотных остатков по сравнению с 1300 у Cas9 [36]. Как и Cas13a с Cas12a, маленький CasX обладает коллатеральной нуклеазной активностью (может неспецифически резать нуклеотидные последовательности, с которыми встретится после связывания с мишенью): она позволяет разрезать олигонуклеотиды с флуоресцентными метками после прикрепления белка к геному вируса. Но ВГС — РНК-содержащий вирус, поэтому для связывания с ним CasX нужно провести дополнительную реакцию: с помощью обратной транскрипции получить комплементарную последовательность ДНК.
Итак, в нашей системе четыре основные стадии (рис. 4):
Пока наша тест-система предполагает определение только одного генетического варианта ВГС — рекомбинантного RF2k/1b, распространенного в России. В 2020 году доступ в лабораторию для нас был закрыт, поэтому систему предстоит еще собрать и протестировать. Если все лабораторные испытания пройдут успешно, мы планируем расширить специфичность системы на все генотипы вируса, не умножая при этом количество приборов.
Рисунок 4. Схема детекции генотипов ВГС с помощью HaploSense
Такая на первый взгляд сложная система позволит определять генотип возбудителя гепатита С быстрее, вне специально оборудованной лаборатории и с не меньшей точностью, чем ПЦР. Мы надеемся, что когда-нибудь такой подход поможет сделать тестирование массовым и доступным.
Подробнее о iGEM
В 2020 году команда студентов с биологического факультета МГУ представила свою разработку на самом престижном международном конкурсе по синтетической биологии — The International Genetically Engineered Machines competition (iGEM). С английского название переводится как «Международное соревнование генно-инженерных машин». Это соревнование учредили в 2003 году в Массачусетском технологическом институте (Бостон, США). Школьники, студенты и аспиранты со всего мира и с разным академическим бэкграундом, начиная от журналистов и экономистов и заканчивая айтишниками и биологами, собираются в команды, в течение года работают над актуальной задачей и представляют свои проекты на осенней, финальной конференции Giant Jamboree. Конкурс iGEM уникален тем, что формирует открытое сообщество людей, которые обмениваются друг с другом и миром своими наработками. Выгодно отличают конкурс также комплексность и разноплановость проектов: упор делается на применение инженерных принципов и подходов, использование методов моделирования, обсуждение и проработку проекта с потенциальными пользователями и экспертами из разных областей (науки, бизнеса, права, государственного управления и т.д.). Образовательная деятельность, популяризация наук, налаживание между учеными и обществом мостов с целью обсуждения актуальных проблем — все это тоже входит в задачи команды. В этом году из-за пандемии конкурс проходил онлайн. Ядро нашей команды составляли студенты биологического факультета МГУ, которые получили бесценный опыт и выиграли золотую медаль. Однако подробнее об iGEM мы поговорим с вами в следующий раз [39].
Работа в команде
В конце марта 2020 года команда Moscow 2019 собрала новый состав для участия в конкурсе iGEM (рис. 5). Тогда впервые встретились незнакомые друг другу люди с общим желанием — создать проект в области синтетической биологии, который мог бы что-то изменить в мире.
Идея нашего проекта появилась только спустя полтора месяца, в начале мая. iGEM предлагает полную тематическую свободу: можно делать хлеб из дрожжей на Марсе, очищать воду бактериями, синтезировать натуральную краску для волос или разрабатывать системы мониторинга заболеваний. На выбор темы для нашего проекта сильно повлиял руководитель команды, Алексей Константинович Шайтан. Его лаборатория использует в работе системы CRISPR-Cas, а на их основе можно создавать детекторы заболеваний. Пандемия COVID-19 только начиналась, но уже было ясно, что SARS-CoV-2 необходимо выявлять быстро, массово и с высокой точностью. Так мы и создали наш проект — с целью детектировать генотипы коронавируса.
Очень важное требование конкурса — актуальность разработки. Другими словами, важно было понять, что наш проект нужен людям и его будут использовать. Этим проекты iGEM сильно отличаются от рутинной работы научных лабораторий. Именно поэтому мы встречались с экспертами, писали письма главному эпидемиологу Министерства здравоохранения, Николаю Ивановичу Брико, размещали посты в социальных сетях. Обратная связь полностью изменила наш проект: HaploSense переориентировался на детекцию генотипов вируса гепатита С.
С другой стороны, важен был сам детектор — как он будет работать, выглядеть, сможем ли мы его вообще собрать. Здесь нам на помощь пришел спонсор, компания BIOCAD. Эксперты компании консультировали нас относительно идеи проекта и ее реализуемости в столь короткие сроки. Они рассказали нам, как готовить патенты и выводить продукт на рынок. А это далеко не простые процессы.
В результате мы проанализировали гору тематической литературы, смогли придумать целостную систему на основе технологий CRISPR-Cas, провели ее моделирование и биоинформатический анализ.
Надо сказать, что организаторы iGEM помогают командам на протяжении всего пути: устраивают семинары, знакомят со специалистами, создают удобные платформы. А особенно поддерживают взаимодействие между командами. Все полгода мы общались и встречались с мотивированными ребятами из Америки, Эстонии, Индии, Франции, Германии и России (в этом году в конкурсе участвовали две команды из нашей страны). После таких встреч мы понимали, что можем сделать хороший, качественный проект, даже будучи студентами.
Рисунок 5. Команда iGEM Moscow 2020
Пандемия, конечно, сыграла свою роль в работе нашей команды: мы работали дистанционно и встречались друг с другом офлайн всего четыре раза. По-настоящему сплоченными мы стали, когда приблизились конкурсные дедлайны. Мы уложились в срок благодаря слаженной работе команды. Одному человеку было бы невозможно справиться: кроме разработки идеи проекта, моделирования и проведения экспериментов нам предстояло сделать сайт с описанием проекта, два видео о команде и работе, заполнить форму безопасности, написать обзор по теме, да и это еще не все. Именно поэтому проект iGEM — прежде всего командная работа.
Итоги конкурса подводятся осенью, в начале ноября, на Giant Jamboree — огромной конференции, где команды, профессора, лекторы и судьи собираются, чтобы обсудить проекты, подметить их сильные и слабые стороны, сформировать новые коллаборации и просто хорошо провести время. Это финал iGEM: проекты уже подготовлены, критерии конкурса соблюдены. Казалось бы, можно выдохнуть… Но здесь же команды встречаются с судьями — исследователями, которые будут оценивать проекты и детально их рецензировать. Мы, конечно, тоже общались с судьями (в этом году онлайн): в воскресенье, в 17:00, нас спрашивали, почему мы использовали LAMP, сколько тест-полосок будем применять, ну и много чего другого. А после нашу команду ждала неделя, полная лекций по синтетической биологии и общения с коллегами со всего мира, а также викторины по синтетической биологии и церемония награждения. В итоге мы выиграли золотую медаль и создали хороший проект, который продолжим развивать и, надеемся, доведем до состояния полноценной тест-системы, подходящей для обычных поликлиник.
Мы советуем всем молодым исследователям принимать участие в iGEM. Этот конкурс стал для нас лучшим событием 2020 года. Создать проект с нуля возможно, нужно только желание!