в чем выражается свойство неперекрываемости генетического кода

Генетический код: свойства и функции

Генетические функции ДНК заключаются в том, что она обеспечивает хранение, передачу и реализацию наследственной информации, которая представляет собой информацию о первичной структуре белков (т.е. их аминокислотном составе). Связь ДНК с синтезом белка была предсказана биохимиками Дж. Бидлом и Э. Тейтумом еще в 1944 г. при изучении механизма мутаций у плесневого грибка Neurospora. Информация записана в виде определенной последовательности азотистых оснований в молекуле ДНК с помощью генетического кода. Расшифровку генетического кода считают одним из великих открытий естествознания ХХ в. и по значимости приравнивают к открытию ядерной энергии в физике. Успех в этой области связан с именем американского ученого М. Ниренберга, в лаборатории которого был расшифрован первый кодон — YYY. Однако весь процесс расшифровки занял более 10 лет, в нем участвовало много известных ученых из разных стран, и не только биологи, но и физики, математики, кибернетики. Решающий вклад в разработку механизма записи генетической информации был внесен Г. Гамовым, который первым предположил, что кодон состоит из трех нуклеотидов. Совместными усилиями ученых была дана полная характеристика генетического кода.

Основными свойствами генетического кода являются: триплетность, вырожденность и неперекрываемость. Триплетность означает, что последовательность из трех оснований определяет включение в молекулу белка специфической аминокислоты (например, АУГ — метионин). Вырожденность кода заключается в том, что одна и та же аминокислота может кодироваться двумя или несколькими кодонами. Неперекрываемость означает, что одно и то же основание не может входить в состав двух соседних кодонов.

Установлено, что код является универсальным, т.е. принцип записи генетической информации одинаков у всех организмов.

Триплеты, кодирующие одну и ту же аминокислоту, называются кодонами-синонимами. Обычно они имеют одинаковые основания в 1-й и 2-й позициях и различаются только по третьему основанию. Например, включение аминокислоты аланина в молекулу белка кодируют кодоны-синонимы в молекуле РНК — GCA, GCC, GCG, GCY. В составе генетического кода имеются три некодирующих триплета (нонсенс-кодоны — UAG, UGA, UAA), которые играют роль stop-сигналов в процессе считывания информации.

Установлено, что универсальность генетического кода не является абсолютной. При сохранении общего для всех организмов принципа кодирования и особенностей кода в ряде случаев наблюдается изменение смысловой нагрузки отдельных кодовых слов. Это явление получило название неоднозначности генетического кода, а сам код был назван квазиуниверсальным.

Читайте также другие статьи темы 6 «Молекулярные основы наследственности»:

Перейти к чтению других тем книги «Генетика и селекция. Теория. Задания. Ответы»:

Источник

32. Клетка как биологическая система Читать 0 мин.

32.275. Генетический код и его свойства

Ранее мы подчёркивали, что нуклеотиды имеют важную для формирования жизни на Земле особенность ― при наличии в растворе одной полинуклеотидной цепочки спонтанно происходит процесс образования второй (параллельной) цепочки на основании комплементарного соединения родственных нуклеотидов. Одинаковое число нуклеотидов, в обоих цепочках и их химическое родство, является непременным условием для осуществления такого рода реакций. Однако при синтезе белка, когда информация с иРНК реализуется в структуру белка никакой речи о соблюдении принципа комплементарности идти не может. Это связано с тем, что в иРНК, и в синтезированном белке различно не только число мономеров, но и, что особенно важно, отсутствует структурное сходство между ними (с одной стороны нуклеотиды, с другой аминокислоты). Понятно, что в этом случае возникает необходимость создания нового принципа точного перевода информации с полинуклеотида в структуру полипептида. В эволюции такой принцип был создан и в его основу был заложен генетический код.

Генетический код ― это система записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот, основанная на определённом чередовании последовательностей нуклеотидов в ДНК или РНК, образующих кодоны, соответствующие аминокислотам в белке.

Генетический код имеет несколько свойств:

Следует отметить, что некоторые авторы предлагают ещё и другие свойства кода, связанные с химическими особенностями входящих в код нуклеотидов или с частотой встречаемости отдельных аминокислот в белках организма и т.д. Однако эти свойство вытекают из вышеперечисленных, поэтому там мы их и рассмотрим.

Генетический код, как и многое сложно организованные система имеет наименьшую структурную и наименьшую функциональную единицу. Триплет ― наименьшая структурная единица генетического кода. Состоит она из трёх нуклеотидов. Кодон ― наименьшая функциональная единица генетического кода. Как правило, кодонами называют триплеты иРНК. В генетическом коде кодон выполняет несколько функций. Во-первых, главная его функция заключается в том, что он кодирует одну аминокислоту. Во-вторых, кодон может не кодировать аминокислоту, но, в этом случае, он выполняет другую функцию (см. далее). Как видно из определения, триплет ― это понятие, которое характеризует элементарную структурную единицу генетического кода (три нуклеотидов). Кодон ― характеризует элементарную смысловую единицу генома ― три нуклеотида определяют присоединение к полипептидной цепочки одной аминокислоты.

Элементарную структурную единицу вначале расшифровали теоретически, а затем её существование подтвердили экспериментально. И действительно, 20 аминокислот невозможно закодировать одним или двумя нуклеотидом т.к. последних всего 4. Три нуклеотида из четырёх дают 43 = 64 варианта, что с избытком перекрывает число имеющихся у живых организмах аминокислот (см.табл. 1).

Представленные в таблице 64 сочетания нуклеотидов имеют две особенности. Во-первых, из 64 вариантов триплетов только 61 являются кодонами и кодируют какую-либо аминокислоту, их называют смысловые кодоны. Три триплета не кодируют.

Таблица 1.

Кодоны информационной РНК и соответствующие им аминокислотыявляются стоп-сигналами, обозначающие конец трансляции. Таких триплетов три ― УАА, УАГ, УГА, их ещё называют «бессмысленные» (нонсенс кодоны). В результате мутации, которая связана с заменой в триплете одного нуклеотида на другой, из смыслового кодона может возникнуть бессмысленный кодон. Такой тип мутации называют нонсенс-мутация. Если такой стоп-сигнал сформировался внутри гена (в его информационной части), то при синтезе белка в этом месте процесс будет постоянно прерываться ― синтезироваться будет только первая (до стоп-сигнала) часть белка. У человека с такой патологией будет ощущаться нехватка белка и возникнут симптомы, связанные с этой нехваткой. Например, такого рода мутация выявлена в гене, кодирующем бета-цепь гемоглобина. Синтезируется укороченная неактивная цепь гемоглобина, которая быстро разрушается. В результате формируется молекула гемоглобина, лишённая бета-цепи. Понятно, что такая молекула вряд ли будет полноценно выполнять свои обязанности. Возникает тяжёлое заболевания, развивающееся по типу гемолитической анемии (бета-ноль талассемия, от греческого слова «Таласа» ― Средиземное море, где эта болезнь впервые обнаружена).

Механизм действия стоп-кодонов отличается от механизма действия смысловых кодонов. Это следует из того, что для всех кодоны, кодирующие аминокислоты, найдены соответствующие тРНК. Для нонсенс-кодонов тРНК не найдены. Следовательно, в процессе остановки синтеза белка тРНК не принимает участие.

Кодон АУГ (у бактерий иногда ГУГ) не только кодируют аминокислоту метионин и валин, но и является инициатором трансляции.

61 из 64 триплетов кодируют 20 аминокислот. Такое трёхразовое превышение числа триплетов над количеством аминокислот позволяет предположить, что в переносе информации могут быть использованы два варианта кодирования. Во-первых, не все 64 кодона могут быть задействованы в кодировании 20 аминокислот, а только 20 и, во-вторых, аминокислоты могут кодироваться несколькими кодонами. Исследования показали, что природа использовала последний вариант.

Код, при котором одна аминокислота кодируется несколькими триплетами, называется вырожденным или избыточным. Почти каждой аминокислоте соответствует несколько кодонов. Так, аминокислота лейцин может кодироваться шестью триплетами — УУА, УУГ, ЦУУ, ЦУЦ, ЦУА, ЦУГ. Валин кодируется четырьмя триплетами, фенилаланин — двумя и только триптофан и метионин кодируются одним кодоном. Свойство, которое связано с записью одной и той же информации разными символами носит название вырожденность.

Число кодонов, предназначенных для одной аминокислоты, хорошо коррелируется с частотой встречаемости аминокислоты в белках. И это, скорее всего, не случайно. Чем больше частота встречаемости аминокислоты в белке, тем чаще представлен кодон этой аминокислоты в геноме, тем выше вероятность его повреждения мутагенными факторами. Поэтому понятно, что мутированный кодон имеет больше шансов кодировать туже аминокислоту при высокой его вырожденности. С этих позиций вырожденность генетического кода является механизмом защищающим геном человека от повреждений.

Необходимо отметить, что термин вырожденность используется в молекулярной генетики и в другом смысле. Так основная часть информации в кодоне приходится на первые два нуклеотида, основание в третьем положении кодона оказывается малосущественным. Этот феномен называют “вырожденностью третьего основания”. Последняя особенность сводит до минимума эффект мутаций. Например, известно, что основной функцией эритроцитов крови является перенос кислорода от легких к тканям и углекислого газа от тканей к легким. Осуществляет эту функцию дыхательный пигмент — гемоглобин, который заполняет всю цитоплазму эритроцита. Состоит он из белковой части ― глобина, который кодируется соответствующим геном. Кроме белка в молекулу гемоглобина входит ген, содержащий железо. Мутации в глобиновых генах приводят к появлению различных вариантов гемоглобинов. Чаще всего мутации связаны с заменой одного нуклеотида на другой и появлением в гене нового кодона, который может кодировать новую аминокислоту в полипептидной цепи гемоглобина. В триплете, в результате мутации может быть заменён любой нуклеотид ― первый, второй или третий.

Известно несколько сотен мутаций, затрагивающих целостность генов глобина. Около 400 из них связаны с заменой единичных нуклеотидов в гене и соответствующей аминокислотной заменой в полипептиде. Из них только 100 замен приводят к нестабильности гемоглобина и различного рода заболеваниям от легких до очень тяжелых. 300 (примерно 64%) мутаций-замен не влияют на функцию гемоглобина и не приводят к патологии. Одной из причин этого является упомянутая выше “вырожденность третьего основания”, когда замена третьего нуклеотида в триплете, кодирующем серин, лейцин, пролин, аргинин и некоторые другие аминокислоты приводит к появлению кодона-синонима, кодирующего ту же аминокислоту. Фенотипически такая мутация не проявится. В отличие от этого любая замена первого или второго нуклеотида в триплете в 100 % случаях приводит к появлению нового варианта гемоглобина. Но и в этом случае тяжёлых фенотипических нарушений может и не быть. Причиной этому является замена аминокислоты в гемоглобине на другую сходную с первой по физико-химическим свойствам. Например, если аминокислота, обладающая гидрофильными свойствами, заменена на другую аминокислоту, но с такими же свойствами.

Гемоглобин состоит из железопорфириновой группы гема (к ней и присоединяются молекулы кислорода и углекислоты) и белка — глобина. Гемоглобин взрослого человека (НвА) содержит две идентичные a-цепи и две b-цепи. Замена в гене, кодирующем b-цепь гемоглобина первого или второго нуклеотида практически всегда приводит к появлению в белка новых аминокислот, нарушению функций гемоглобина и тяжёлым последствия для больного. Например, замена “Ц” в одном из триплетов ЦАУ (гистидин) на “У” — приведет к появлению нового триплета УАУ, кодирующего другую аминокислоту — тирозин. Фенотипически это проявится в тяжёлом заболевании. Аналогичная замена в 63 положении b-цепи полипептида гистидина на тирозин приведет к дестабилизации гемоглобина. Развивается заболевание метгемоглобинемия. Замена, в результате мутации, глутаминовой кислоты на валин в 6-м положении b-цепи является причиной тяжелейшего заболевания — серповидно-клеточной анемии. Не будем продолжать печальный список. Отметим только, что при замене первых двух нуклеотидов может появится аминокислота по физико-химическим свойствам похожая на прежнюю. Так, замена 2-го нуклеотида в одном из триплетов, кодирующего глутаминовую кислоту (ГАА) в b-цепи на “У” приводит к появлению нового триплета (ГУА), кодирующего валин, а замена первого нуклеотида на “А” формирует триплет ААА, кодирующий аминокислоту лизин. Глутаминовая кислота и лизин сходны по физико-химическим свойствам — они обе гидрофильны. Валин — гидрофобная аминокислота. Поэтому, замена гидрофильной глютаминовой кислоты на гидрофобный валин, значительно меняет свойства гемоглобина, что, в конечном итоге, приводит к развитию серповидноклеточной анемии, замена же гидрофильной глютаминовой кислоты на гидрофильный лизин в меньшей степени меняет функцию гемоглобина — у больных возникает легкая форма малокровия. В результате замены третьего основания новый триплет может кодировать туже аминокислоты, что и прежней. Например, если в триплете ЦАУ урацил был заменён на цитозин и возник триплет ЦАЦ, то практически никаких фенотипических изменений у человека выявлено не будет. Это понятно, т.к. оба триплета кодируют одну и туже аминокислоту ― гистидин.

В заключении уместно подчеркнуть, что вырожденность генетического кода и вырожденность третьего основания с общебиологических позиция являются защитными механизмами, которые заложены в эволюции в уникальной структуре ДНК и РНК.

Каждый триплет (кроме бессмысленных) кодирует только одну аминокислоту. Таким образом, в направлении кодон ― аминокислота генетический код однозначен, в направлении аминокислота ― кодон ― неоднозначен (вырожденный).

И в этом случае необходимость однозначности в генетическом коде очевидна. При другом варианте при трансляции одного и того же кодона в белковую цепочку встраивались бы разные аминокислоты и в итоге формировались белков с различной первичной структурой и разной функцией. Метаболизм клетки перешёл бы в режим работы «один ген ― несколько поипептидов». Понятно, что в такой ситуации регулирующая функция генов была бы полностью утрачена.

Считывание информации с ДНК и с иРНК происходит только в одном направлении. Полярность имеет важное значение для определения структур высшего порядка (вторичной, третичной и т.д.). Ранее мы говорили о том, что структуры низшего порядка определяют структуры более высшего порядка. Третичная структура и структуры более высокого порядка у белков, формируются сразу же как только синтезированная цепочка РНК отходит от молекулы ДНК или цепочка полипептида отходит от рибосомы. В то время, когда свободный конец РНК или полипептида приобретает третичную структуру, другой конец цепочки ещё продолжает синтезироваться на ДНК (если транскрибируется РНК) или рибосоме (если транскрибируется полипептид).

Поэтому однонаправленный процесс считывания информации (при синтезе РНК и белка) имеет существенное значение не только для определения последовательности нуклеотидов или аминокислот в синтезируемом веществе, но для жёсткой детерминации вторичной, третичной и т.д. структур.

Код может быть перекрывающимся и не перекрывающимся. У большинства организмов код не перекрывающийся. Перекрывающийся код найден у некоторых фагов.

Сущность не перекрывающего кода заключается в том, что нуклеотид одного кодона не может быть одновременно нуклеотидом другого кодона. Если бы код был перекрывающим, то последовательность из семи нуклеотидов (ГЦУГЦУГ) могла кодировать не две аминокислоты (аланин-аланин) (рис.33, А) как в случае с не перекрывающимся кодом, а три (если общим является один нуклеотид) (рис. 33, Б) или пять (если общими являются два нуклеотида) (см. рис. 33, В). В последних двух случаях мутация любого нуклеотида привела бы к нарушению в последовательности двух, трёх и т.д. аминокислот.

Однако установлено, что мутация одного нуклеотида всегда нарушает включение в полипептид одной аминокислоты. Это существенный довод в пользу того, что код является не перекрывающимся. Неперекрываемость генетического кода связана с ещё одним свойством ― считывание информации начинается с определённой точки ― сигнала инициации. Таким сигналом инициации в иРНК является кодон, кодирующий метионин АУГ. Следует отметить, что у человека всё-таки имеется небольшое число генов, которые отступают от общего правила и перекрываются.

Между кодонами нет знаков препинания. Иными словами триплеты не отделены друг от друга, например, одним ничего не значащим нуклеотидом. Отсутствие в генетической коде «знаков препинания» было доказано в экспериментах.

Код един для всех организмов, живущих на Земле. Прямое доказательство универсальности генетического кода было получено при сравнении последовательностей ДНК с соответствующими белковыми последовательностями. Оказалось, что во всех бактериальных и эукариотических геномах используется одни и те же наборы кодовых значений. Есть и исключения, но их не много.

Первые исключения из универсальности генетического кода были обнаружены в митохондриях некоторых видов животных. Это касалось кодона терминатора УГА, который читался так же как кодон УГГ, кодирующий аминокислоту триптофан. Были найдены и другие более редкие отклонения от универсальности.

Для повторения:

Генетический код ― это система записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот, основанная на определённом чередовании последовательностей нуклеотидов в ДНК или РНК, образующих кодоны, соответствующие аминокислотам в белке. Генетический код имеет несколько свойств.

1. Триплетность. Триплет состоит из трёх нуклеотидов. 61 кодон ― смысловые, т.е. кодируют какую-либо аминокислоту, три ― бессмысленные, т.е. не кодируют аминокислоты.

2. Вырожденность или избыточность. Одна аминокислота может кодироваться несколькими кодонами.

3. Однозначность. Один кодон кодирует только одну аминокислоту.

4. Полярность. Считывание информации с ДНК и с иРНК происходит только в одном направлении.

5. Неперекрываемость. Генетический код является не перекрывающимся.

6. Компактность. Между кодонами нет знаков препинания.

7. Универсальность. Код един для всех живущих на земле организмов.

Источник

Генетический код. Биосинтез белка

теория по биологии 🌿 основы генетики

Генетическая информация и генетический код

Каждый вид имеет свой собственный, отличный от других видов, набор белков. Интересно то, что белки, выполняющие идентичные функции у разных видов могут быть похожими или даже абсолютно идентичными.

У белков есть несколько состояний их структур:

Именно первичная структура является определяющей свойства белка. Эта структура – цепь из аминокислот. Аминокислоты, в свою очередь, представляют собой ряд триплетов из нуклеотидов. Решая генетические задачи, обращаются как раз-таки к знакомой таблице:

Каждая аминокислота кодируется тремя нуклеотидами, которые составляют триплет или иначе кодон. Именно последовательность нуклеотидов называется генетической информацией, а участок последовательности, в котором хранится информация о первичной структуре белка это и есть ген.

Нуклеотиды, составляющие ДНК и РНК различаются:

В состав ДНК входят:

В состав РНК входят:

Кроме того, в составе РНК (рибонуклеиновой кислоты) сахар рибоза, а ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) — дезоксирибоза. РНК — одноцепочечная, а ДНК — двухцепочечная.

Между нуклеотидами есть водородные связи. Они могут быть как двойные, так и тройные. Нуклеотиды не могу быть связаны в случайном порядке. Для этого существует принцип комплементарности ДНК, по которому аденин одной цепи ДНК соединяется с тимином другой цепи ДНК, другая пара в ДНК – гуанин – цитозин. В РНК все аналогично, за исключением того, что вместо тимина там урацил. Между парами А-Т/А-У – две водородных связи, а между парами Ц-Г – три. На письме это обозначается чёрточками: двойная связь как знак «равно», а тройная – три горизонтальные черты.

Свойства генетического кода

Транскрипция и трансляция

Из цитологии известно, что генетическая информация у эукариотических клеток заключена в ядре в виде ДНК. Однако процесс биосинтеза белка происходит в цитоплазме на рибосомах.

Спиральная цепь ДНК при раскручивается, в это время по одной из цепочек ДНК строится комплементарная цепь. Из ядра в цитоплазму информация выходит в виде информационной РНК (иРНК). иРНК комплементарная одной из цепей ДНК. Этот процесс переписывания называется транскрипцией. Полученная цепь практически идентичная другой цепи ДНК, за исключением того, что вместо тимина там урацил.В процессе участвует специальный фермент РНК-полимераза.

Теперь в ядре есть цепочка, которая уже начала процесс биосинтеза. Как говорилось выше, процесс ассимиляции идет на рибосомах. иРНК выходит в цитоплазму через поры ядерной мембраны

тРНК по форме напоминает лист клевера, а по принципу работы – штамп. На него, прямо как чернила, наслаиваются кодоны.

В цитоплазме начинается процесс трансляции, то есть перевод последовательности нуклеотидов информационной РНК в последовательность аминокислот белка.

Рибосома захватывает стартовый конец цепи иРНК. Затем она начинает двигаться по цепи, одна остановка рибосомы происходит на 6-ти нуклеотидах. В это время молекула тРНК, на которых есть триплет аминокислоты «подлетает» к цепи, в месте, где находится рибосома. За время остановки рибосомы транспортная РНК успевает распознать свою пару на цепи иРНК, которая называется антикодоном. Тогда тРНК «ставит свой штамп», оставляя на цепи свой кодон. Между нуклеотидами образуются водородные связи. Так нарастает новая цепь. На одной информационной РНК работает сразу много рибосом, поэтому работа идет очень быстро. Совокупность рибосом, синтезирующих на одной иРНК, называется полисомой.

По окончанию процесса биосинтеза, цепочка отсоединяется от рибосомы и принимает свою природную структуру: вторичную, третичную или четвертичную.

pазбирался: Надежда | обсудить разбор | оценить

В современной генетической инженерии часто применняют технологии, связанные с гомологичной рекомбинацией ДНК непосредственно в живом объекте. Один из примеров – система CRE-Lox P. Lox P – это последовательность нуклеотидов в ДНК фага Р1. Она состоит из 34 нуклеотидов. В середине располагается несимметричная последовательность из 8 нуклеотидов (показана серой стрелкой на рисунке). По краям располагаются так называемые палиндромные последовательности из 13 нуклеотидов (выделены на рисунке как пунктирные блоки). Они симметричны (чтобы в этом убедиться, достаточно прочитать обе последовательность от 5´- конца к 3´- концу). Именно эти палиндромные участки узнаёт особый фермент, вызывающий рекомбинацию, который обозначают CRE. Будем в дальнейшем называть этот фермент рекомбиназой CRE. Для того, чтобы состоялась рекомбинация, два сайта Lox P должны расположиться параллельно друг другу. Рекомбиназа CRE узнает эти сайты, внесет в ДНК разрезы в определённых местах, а затем соединит по-новому две нити ДНК (т.е. произойдет рекомбинация). Аналогично работает и другая система гомологичной рекомбинации – Flp-FRT, обнаруженная у пекарских дрожжей. Сайт FRT – это последовательность ДНК, которую узнает свой фермент гомологичной рекомбинации – флиппаза (Flp). При рекомбинации две молекулы ДНК должны ориентироваться параллельно друг другу сайтами FRT, и только в этом случае произойдёт рекомбинация. Заметим, что флиппаза Flp узнает только свою последовательность FRT, но не может работать с сайтами Lox P, а рекомбиназа CRE узнает только свои сайты Lox P, но не работает с сайтами FRT. Предварительное доказательство (лемма) к задаче 9 (5 баллов). 1. Докажем, что при гомологичной рекомбинаци по «перевёрнутым» (инвертированным) повторам происходит «переворот» последовательности ДНК, находящейся между повторами. Для этого нарисуем молекулу ДНК и условно обозначим на ней буквами несколько точек. Затем «изогнём» молекулу так, чтобы повторы, обозначенные стрелками, встали параллельно друг другу. После обмена участками и «распрамления» окажется, что центральная часть между повторами «перевернулась». 2. Докажем, что при гомологичной рекомбинаци по прямым повторам происходит образование кольцевой ДНК, при этом из линейной последовательности ДНК «удаляется» участок, находящейся между повторами. Для этого используем тот же приём: нарисуем молекулу ДНК и условно обозначим на ней буквами несколько точек. Только в этом случае для того, чтобы прямые повторы встали параллельно друг другу, придётся хитроумно изогнуть молекулу так, чтобы от конца одного из повторов (точка С) шли точки D, E, F, а потом начинался новый повтор (в точке G). После рекомбинации точки С и G поменяются местами, и в результате получится кольцевая ДНК (C, D, E, F, G) и линейный участок (A, B, H, J). Будем считать, что кольцевая ДНК как бы «исчезает» (не может реплицироваться в клетке). А. Поскольку после 35S-промотора на той же цепи ДНК располагается кодирующая часть гена DsRed, клетки должна светиться красным светом. Б. Рекомбиаза CRE узнаёт последовательнсоти LoxP. Если повторы расположены инвертированно, то произойдёт «переворот» последовательности ДНК, расположенной между повторами. Таким образом, после рекомбинации конструкция будет выглядеть следущим образом: Свечение клеток изменится, поскольку после промотора на той же цепи ДНК окажется гена BFP, обестпечивающий синее свечение клеток. В. При рекомбинации по прямым повторам происходит потеря участка ДНК, расположенного между ними. Из двух повторов остаётся только один. Таким образом, после рекомбинации по сайтам FRT конструкция будет выглядеть следующим образом: Клетки будут светиться зелёным светом за счёт того, что под промотором оказалась кодирующая последовательность гена GFP. Г. После действия рекомбиназы CRE те последовательности, на которые может действовать флип паза Flp, «перевернулись», и вместо прямых стали инвертрованными. После рекомбинации участок между ними также должен «перевернуться»: В этом случае клетки также будут светиться зелёным светом за счёт того, что под промотором оказалась кодирующая последовательность гена GFP.

pазбирался: Надежда | обсудить разбор | оценить

pазбирался: Надежда | обсудить разбор | оценить

Сначала найдём место расщепления плазмиды рестриктазой BglII: Таких участков оказывается два. В результате расщепления из плазмиды выщепляется короткий фрагмент: Остаётся укороченная линейная ДНК, содержащая интактный ген устойчивости к ампицилину и расщеплённый ген устойчивости к эритромицину. При сшивании липких концов ДНК-лигазой наиболее часто будут соединяться концы этой молекулы и образовываться кольцо длиной 4163 нуклеотида. Такая ДНК будет сообщать клеткам устойчивость к ампицилину и не даст устойчивости к эритромицину. Второй фрагмент из-за небольшой длины не может замкнуться в кольцо. Второй вариант лигирования приводит к сшиванию липких концов двух фрагментов. Он происходит примерно в 10 раз реже, а после сшивки вторая пара липких концов скорее всего также, как и исходный фрагмент замкнётся в кольцо. Таких колец из пары фрагментов может образоваться 4 вида: димеры большого фрагмента в двух разных ориентациях (правый конец с левым концом второго фрагмента и левый конец с правым концом второго фрагмента или правый с правым и левый с левым) и соединения большого и малого фрагмента в двух разных ориентациях (вариант исходной плазмиды и инверсия малого фрагмента). Из них только в варианте исходной плазмиды восстанавливается устойчивость к эритромицину. Линейная молекула, образованная сшиванием двух фрагментов, может присоединить ещё один фрагмент с ещё в 10 раз меньшей частотой. Такие фрагменты в дальнейшем будут циклизоваться в плазмиды трёх размеров: из трёх больших фрагментов, из двух больших и одного малого и одного большого и двух малых. Три малых фрагмента дадут короткую последовательность, которая не сможет замкнуться в кольцо и существовать в клетке. В каждом размерном классе будет несколько вариантов с разной ориентацией фрагментов. Только в одном из них восстановится ген устойчивости к эритромицину: правый конец большого фрагмента соединяется с левым концом малого фрагмента, а правый конец малого фрагмента – с левым концом второго большого фрагмента, а оставшиеся концы двух больших фрагментов соединяются с образованием кольцевой плазмиды длиной 8363 пары нуклеотидов. Доля таких молекул будет менее 1% всех плазмид. Вероятность образования плазмид из 4 и более фрагментов ещё на порядок ниже и их обнаружение при данном числе полученных трансформированных клеток нереально. А. Так как расщепление рестриктазой не затрагивает ген устойчивости к ампицилину, все клетки, в результате трансформации получившие любую плазмиду, будут устойчивы к ампицилину и вырастут на среде с этим антибиотиком. Таким образом из 33506 выросших колоний плазмиду получили 578, выросших на ампицилине. Эффективность трансформации представляет долю трансформированных клеток от общего их числа, т.е. 573 : 51366 × 100% = 1.12% Б. На эритромицине могут вырасти только те клетки, в которые попали плазмиды, в которых в результате лигирования восстановится последовательность нуклеотидов в гене устойчивости к этому антибиотику, расщеплённому рестриктазой. Остальные плазмиды, полученные по приведённой методике, будут содержать либо ген с выщепленным коротким фрагментом, что приведёт либо к утрате стартового кодона (если обозначенный зелёным цветом кодон является стартовым), либо к сдвигу рамки считывания (т.к. число удалённых нуклеотидов не кратно трём), либо, при инверсии короткого фрагмента, к появлению стоп-кодонов т.е. прекращению синтеза белка. Таким образом большинство полученных плазмид не обеспечат устойчивости к эритромицину. В. Рост на эритромицине могут обеспечить только плазмиды, несущие восстановленную последовательность гена устойчивости. Такие плазмиды могли образоваться из одного большого и одного малого фрагмента (4200 пар, исходная плазмида)) или из двух больших и одного малого (8363 пары, начало и конец гена из разных копий большого фрагмента). Г. Получается 1 размер из одного большого фрагмента, два размерных класса из двух фрагментов и три размерных класса из трёх фрагментов, то есть 6 размерных классов. (В реальности различить по длине плазмиды, отличающиеся на длину малого фрагмента, т.е. менее чем на 0,5%, невозможно. Поэтому в эксперименте, например на электрофореграмме, будут видны лишь три размерных класса, соответствующие 1, 2 или 3 копиям большого фрагмента.)

pазбирался: Надежда | обсудить разбор | оценить

По принципу комплементарности строим

Источник