Естественные среды представляют собой природные субстраты (молоко, кровь, желчь, сыворотка, картофель). Искусственные содержат смесь природных органических веществ и продуктов их кислотного или ферментативного распада. Синтетические среды состоят из буферной солевой основы и растворов аминокислот, углеводов, пуринов, пиримидинов, нуклеотидов, нуклеозидов, жирных кислот, витаминов в точно установленных дозировках. В качестве источников азота в них используются аминокислоты. Достоинство этих сред в том, что они имеют постоянный состав, по ним можно определить потребности микробов в тех или иных питательных веществах.
Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар – продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Для иммунологических и бактериологических полей используется вымороженный, осветленный агар, который при кипячении или автоклавировании смеси порошка с водой расплавляется при температуре 85–100°С, а при охлаждении до 45–48°С образует гель.
Для приготовления, плотных питательных сред агар-агар добавляют в концентрации от 1,5 до 3%.
Простые среды.
Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.
Существует несколько способов приготовления МПБ:
а) на мясной воде с добавлением готового пептона – это так называемый мясо-пептонный бульон;
б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина – бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена).
Мясо-пептонный агар (МПА) – получают путей добавления к МПБ arap-arapa (1,5–3%). Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона – это скошенный агар. Для его получения пробирки для застывания среды оставляют в наклонном положении. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5–7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде пластинки – пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2–3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.
Специальные питательные среды – среды, на которых создаются условия для выращивания тех бактерий, которые не растут на простых средах.
Кровяной агар или кровяной бульон – получают путем добавления к питательной среде 5–10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности.
Сывороточный бульон или сывороточный агар получают путем добавления к простым средам 15–20% лошадиной или бычьей сыворотки. Среда применяется для выделения пневмококков, менингококков.
Желчный бульон или желчный агар получают путем добавления к питательной среде медицинской желчи без консерванта, или свежеполученной от крупного рогатого скота. Среда применяется для выделения брюшнотифозных, паратифозных и дизентерийных палочек.
Специальные среды для культивирования анаэробных бактерий: среда Китта-Тароцци состоит из питательного бульона, глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода.
Желатин – животный белок, продукт частичного гидролиза коллагена. Имеет вид бесцветных или светло-желтых пластинок без запаха и вкуса. В холодной воде набухает, сильно поглощая воду. При температуре 30°С растворяется, при охлаждении до 20–22°С превращается в гель (студень). Используется в микробиологии для изучения протеолитических ферментов.
Дифференциально-диагностические среды позволяют различить один вид микроба от другого. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на разной биохимической активности бактерий. В состав дифференциально-диагностических сред входит основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, определенный химический субстрат, различное отношение к которому является диагностическим признаком, индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о разложении субстрата и образовании кислых продуктов.
Агар Эндо – плотная среда, применяется для выделения и первичной идентификации энтеробактерий. В состав ее входят, кроме питательной основы, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом и фосфатом натрия. Правильно приготовленная среда бесцветна или имеет слегка розовый оттенок. Колонии бактерий (кишечная палочка), ферментирующие лактозу, окрашиваются на ней в красный цвет; бактерии, не ферментирующие лактозу (сальмонеллы), остаются бесцветными.
Среда Левина (лактозоэозинметиленовый агар) – среда для выделения энтеробактерий. Колонии лактозоферментирующих бактерий окрашены в темно-синий или черный цвет, колонии лактозоотрицательных бактерий вырастают под цвет среды (светло-фиолетового цвета).
Среды Гисса – набор определенных углеводов для изучения ферментативной активности бактерий и их дифференциации по этим признакам.
Элективные питательные среды содержат дополнительные вещества, задерживающие рост грамположительных бактерий. Селективные питательные среды стимулируют рост одних микробов и угнетают рост других. Селективные условия получают путем добавления в среду химических веществ. Так как в этих средах патогенные бактерии размножаются и накапливаются, их называют также средами обогащения.
Среда Плоскирева – плотная питательная среда, содержащая соли желчных кислот, бриллиантовый зеленый, лактозу и индикатор. Эта среда является не только селективной, так как подавляет рост многих микробов и способствует лучшему росту возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерии, но и дифференциально-диагностической, так как лактозоотрицательные бактерии (шигеллы) образуют на ней бесцветные колонии, а лактозоположительные – кирпично-красные.
Среда Мюллера служит для накопления сальмонелл. К питательной среде добавляют мел, раствор Люголя и гипосульфит натрия. При взаимодействии этих веществ образуется тетратионат натрия, который угнетает рост кишечных палочек, но создает благоприятные условия для размножения сальмонелл.
Висмут-сульфит агар (среда Вильсона-Блера) – содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний чернота цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.
Желточно-солевой агар (ЖСА) – среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».
Теллуритовые среды (сывороточно-теллуритовый агар, кровяно-теллуритовый агар) – селективные среды для выделения дифтерийных бактерий, содержат теллурит калия. Бесцветная соль теллура, содержащаяся в питательной среде, восстанавливается дифтерийными бактериями до металла, окрашивающего колонии в черный цвет.
Щелочной агар элективен для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.
Консервирующие среды – среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Консервирующие среды применяются, когда нет возможности быстрого посева на питательные среды.
Для бактерий наиболее употребительны консерванты:
а) глицериновая смесь, состоящая из 0,5 л химически чистого глицерина и 1,0 л физиологического раствора;
в) фосфатно-буферная смесь.
Для длительного сохранения свежевыделенных и производственных культур применяют полужидкий голодный агар, в этой среде при пониженной жизнедеятельности микробов продукты обмена накапливаются незначительно, что способствует хорошему сохранению культур.
Специальные среды.
В бактериологии широко применяются сухие питательные среды промышленного производства, которые представляют собой гигроскопические порошки, содержащие все компоненты среды, кроме воды. Для их приготовления используются триптические перевары дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин).
Они удобны при транспортировке, могут длительно храниться, избавляют лаборатории от громадного процесса приготовления сред, приближают к разрешению вопроса о стандартизации сред. Медицинская промышленность производит сухие среды Эндо, Левина, Плоскирева, висмутсульфит агар, питательный агар, углеводы с индикатором ВР и другие.
Термостаты
Для культивирования микроорганизмов используют термостаты.
Термостат – это аппарат, в котором поддерживают постоянную температуру. Прибор состоит из нагревателя, камеры, двойных стенок, между которыми циркулирует воздух или вода. Температура регулируется терморегулятором. Оптимальная температура для размножения большинства микроорганизмов 37°С.
Методика приготовления пластинчатого агара
МПА расплавляют на водяной бане, затем остужают до 50-55°С. Горлышко флакона обжигают в пламени спиртовки, открывают чашки Петри так, чтобы вошло горлышко флаконы, не прикасаясь к краям чашки, выливают 10–15 мл МПА, закрыв крышку, покачивают чашку, чтобы среда равномерно распределилась, оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. После подсушивания чашки с пластинчатым агаром хранят на холоде.
Посев петлей
Стерильной остуженной петлей берут каплю материала, левой рукой приоткрывают один край чашки, вносят петлю внутрь и у противоположного края делают петлей несколько штрихов на одном месте, затем петлю отрывают и засевают материал параллельными штрихами от одного края чашки к другому с интервалом 5–6 мм. В начале посева, когда микробов на петле будет много, они дадут сливной рост, но с каждым штрихом микробов на петле остается все меньше, и они будут оставаться одиночными и давать изолированные колонии.
Посев по методу Дригальского
Этот метод используется при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой (гной, испражнения, мокрота). Для посева по методу Дригальского берут шпатель и несколько чашек (3–4). Шпатель – это инструмент, изготовленный из металлической проволоки или стеклянного дрота, загнутого в виде треугольника или Г-образно. Материал петлей или пипеткой вносят в первую чашку и равномерно распределяют шпателем по поверхности среды, этим же шпателем, не прожигая его, втирают материал в питательную среду во второй чашке, а затем – в третьей. При таком посеве в первой чашке будет сливной рост, а в последующих чашках вырастают изолированные колонии.
Выделение чистой культуры по Щукевичу
Для посева берут свежеприготовленную питательную среду с конденсатом. Исследуемый материал забирают петлей и вносят его осторожно, соблюдая правила асептики, не касаясь среды и стенок, в конденсационную воду. Бактерии с высокой подвижностью «выползают» на влажную поверхность скошенного агара.
В результате самостоятельной работы студент должен знать:
1. Классификацию, морфологию грибов, их методы изучения.
2. Классификацию и морфологию актиномицетов.
3. Правила противоэпидемических режимов и техники безопасности.
Уметь:
1. Дифференцировать микроорганизмы при микроскопии.
2. Микроскопировать окрашенные препараты.
3. Обеззараживать материал, обрабатывать руки дезинфирующими препаратами.
Микробиология: методы Правила работы в микробиологической лаборатории Приготовление прапаратов для микроскопии Исследование окрашенных препаратов Кровь: микробиологическое исследование Микроскопия вирусов Питательные среды Стерилизация лабораторного оборудования Среды для дрожжей и грибов
Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифицировано Левином и Шенлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк — от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения патогенных микроорганизмов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Различают два основных типа питательных сред: так называемые синтетические среды, главные составные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизвестен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка).
Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Герберт настойчиво высказывался за повсеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона (например, по составу и по скорости деления). Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства со временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава типа бульонов, приготовленных из перевара, используются весьма широко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.
В литературе опубликованы результаты количественных анализов многих питательных сред природного происхождения, что является определенным шагом на пути к их стандартизации. Однако данными этих анализов следует пользоваться с осторожностью, поскольку результаты определений, проведенных независимо друг от друга, демонстрируют существенные различия состава различных партий одной и той же питательной среды. Более того, при проведении анализов обычно игнорируется наличие в питательных средах многих существенно важных составных частей, хотя ясно, что компоненты, требуемые в следовых количествах, например витамины и катионы, могут присутствовать в исключительно малой концентрации. При этом может оказаться, что размножение бактерий идет нормально, тогда как процессы типа споруляции или адсорбции фага ингибируются.
В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азот, углерод, водород, кислород, неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды.
По характеру усвоения азота патогенные микроорганизмы делятся следующим образом: одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты неполного ферментативного переваривания белков. Строго паразитические виды бактерий размножаются только в присутствии нативного, т. е. неизмененного, белка.
Источником углерода для патогенных бактерий являются, главным образом, различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.
Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI, KH2PO4, K2HPO4 и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой.
Наряду с перечисленными органическими и неорганическими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.
Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.
Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.
Исходные продукты для приготовления питательных сред. Для приготовления питательных сред используют:
· Продукты животного происхождения (мясо, рыба, казеин, молоко, яйца, кровь и т. д.).
· Продукты растительного происхождения (картофель и др.).
· Органические и неорганические соединения определенного химического состава.
Питательные среды, приготовленные из продуктов растительного и животного происхождения, несмотря на то, что они не могут быть стандартны и не имеют определенного химического состава, находят широкое применение в практике микробиологии. Синтетические питательные среды, составленные из химических соединений, используют преимущественно для изучения обмена веществ микробной клетки.
Требования, предъявляемые к питательным средам. Питательные среды должны:
· Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества.
· Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.
· Иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса.
· Быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микробов.
Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.
К первой группе относятся мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба.
К специальным питательным средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-днагностическне.
Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строгом значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной.
Дифференциально-диагностические питательные среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом:
· Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровяную сыворотку и т. д.
· Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами.
· Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.
· Среды для определения редуцирующей способности микробов.
В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральный красный, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.
Сухие питательные среды.
Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов.
Приготовление обычных питательных сред. Основой для приготовления этих сред служит мясная вода, содержащая экстрактивные вещества.
Питательные среды готовят в кастрюлях, эмалированных или из нержавеющей стали. Готовые питательные среды разливают во флаконы, пробирки, чашки.
Новую стеклянную посуду кипятят в 1—2% растворе соляной кислоты для нейтрализации растворимой щелочи, затем тщательно промывают в проточной воде и сушат. Посуду, бывшую в употреблении, стерилизуют, затем моют, прополаскивают и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками.
1. 100 г свежей говядины или телятины освобождают от костей, жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, фарш заливают 1 литром водопроводной воды, хорошо размешивают. Оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 часа в термостат.
2. Мясную пасту отжимают через марлю, кипятят в течение 5 минут. Для свертывания белков дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема. Мясную воду разливают во флаконы, стерилизуют 20-30 минут при 120°С и сохраняют в темном месте. Она имеет вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (рН 6,2—6,4), без белков. В мясной воде содержится небольшое количество аминокислот, солей, углеводов, факторов роста и экстрактивных веществ. Для приготовления обычных питательных сред к мясной воде прибавляют сухой пептон, который является первичным продуктом гидролиза белка и состоит из смеси полипептидов и аминокислот, полученных путем пептического или триптического переваривания.
На мясокомбинатах для производства сухого пептона используют фибрин, кровь и другие отходы. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке.
Жидкий пептон можно приготовить в лабораторных условиях путем пептического переваривания белков.
Свиные желудки (не промытые водой) с обильным слизистым слоем очищают от пленок, жира и пропускают через мясорубку. К фаршу прибавляют воду и соляную кислоту в следующем соотношении: фарш из свиных желудков 250 г, вода водопроводная, нагретая до 50°С, 1000 мл, соляная кислота (удельный вес 1,18) 10 мл. Смесь выдерживают в термостате при 50°С. Через 24 часа пептон прогревают в автоклаве при 100°С и фильтруют, фильтрат подщелачивают 10% раствором NaOH до щелочной реакции по лакмусу. После этого фильтрат разливают в колбы и стерилизуют при 115°С 30 минут.
Для приготовления бульона пептон Мартена смешивают с равным объемом мясной воды, устанавливают необходимую реакцию, кипятят 30 минут, фильтруют и стерилизуют при 115°С 30 минут.
Мясо можно переваривать с помощью трипсина — перевар Хоттингера, при этом более полно используют белки мяса, которые расщепляются до пептонов, полипептидов и свободных аминокислот. При триптическом переваривании мяса получают в 10 раз больше бульона, чем при обычном методе.
Мясной перевар Хоттингера.
Мясо, освобожденное от жира и сухожилий, нарезают небольшими кусочками, помещают в кастрюлю с кипящей водопроводной водой (в полуторном объеме) и кипятят 15—20 минут, затем мясо извлекают из жидкости и пропускают через мясорубку. Установив рН охлажденной до 40—45°С жидкости, равный 8, заливают ею фарш. К полученной смеси добавляют сухой панкреатин в количестве 0,5—1% или поджелудочную железу из расчета 100 г железы на 1 л жидкости. Затем смесь снова подщелачивают до рН 8 и разливают ее в бутыль. Туда же добавляют 2—3% хлороформа и, закрыв бутыль резиновой пробкой, несколько раз встряхивают содержимое. Бутыль ставят на 7—14 суток при температуре 37°С.
В результате переваривания мясной фарш превращается в гомогенный сероватый осадок, над которым находится совершенно прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета. Перевар Хоттингера хорошего качества дает положительную реакцию на триптофан и содержит 560—860 мг% аминного азота. Для приготовления бульона к 1 части перевара прибавляют 6—7 частей воды.
Приготовление бульона из переваров по Хоттингеру является более экономичным, чем применение мясопептонных сред; из одного и того же количества мяса получают бульона в 5—10 раз больше. Кроме того, можно использовать для переваривания заменители мяса. Наконец, присутствие в переварах значительного количества аминокислот создает буферность, а следовательно, и большую стабильность рН среды.
1. Перевар по Хоттингеру.
1кг мяса, очищенного от жира и сухожилий, нарезают кусками примерно 1—2 см.
Мясо опускают небольшими порциями в кастрюлю с двойным количеством (по отношению к мясу) кипящей водопроводной воды; кипятят 15—20 минут, пока мясо не станет серым, что указывает на то, что белки свернулись. Мясо вынимают шумовкой и пропускают его через мясорубку. Устанавливают в жидкости рН 8,0. Опускают фарш в жидкость и охлаждают до 40° в открытой кастрюле, затем добавляют поджелудочную железу (очищенную от жира, соединительной ткани и дважды пропущенную через мясорубку) 1 в количестве 10% к взятой жидкости (на 1 л жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в количестве 0,5% и выше в зависимости от его активности. Хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают смесь до рН 7,8—8,0 и повторяют такое подщелачивание через 30 минут. Отсутствие сдвига реакции смеси в сторону окисления указывает не недоброкачественность фермента. После установления рН смесь переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой с таким расчетом, чтобы 1/3 бутыли оставалась свободной. Добавляют 1—3% хлороформа — 10—30 мл на 1 л жидкости (в холодное время года меньше, чем в теплое), закрывают бутыль пробкой и несколько раз встряхивают так, чтобы хлороформ перемещался от дна бутыли к пробке и обратно, после чего на минуту вынимают пробку для освобождения от избытка паров хлороформа. Через 1—2 часа после добавления фермента опять проверяют реакцию и устанавливают рН 7,4—7,6. При этой реакции оставляют смесь для переваривания на 7—10—16 дней при комнатной температуре. Первые 3—4 дня переваривания ежедневно проверяют и исправляют реакцию. В эти дни также встряхивают перевар не менее 3 раз в сутки. В дальнейшем проверку реакции производить нецелесообразно, а встряхивать можно реже; за 1—2 дня до окончания переваривания встряхивания совсем прекращают, чтобы перевар отстоялся.
Конец переваривания характеризуется следующими признаками:
1) на дне бутыли собирается пылевидный осадок;
2) жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет;
3) перевар легко фильтруется;
4) реакция на триптофан с бромной водой должна быть положительной (в пробирку наливают 3—4 мл фильтрованного перевара, добавляют 3-4 капли бромной воды; при наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет (сравнивают с контрольной пробиркой, где к перевару не прибавлена бромная вода);
5) гидролизат перевара доведен до содержания в нем 1100—1200 мг% общего азота.
По окончании гидролиза перевар фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, разливают в бутыли и стерилизуют 30 минут при давлении 1 атм. (120°) для хранения впрок. Перед употреблением фильтруют.
А) Поджелудочную железу можно применять свежую, замороженную или соленую.
Свежую поджелудочную железу можно консервировать впрок. Для этого ее очищают от жира, пропускают через мясорубку и закладывают в стерильную банку, куда добавляют столько глицерина, чтобы он покрыл поверхность. В таком виде ее можно хранить на холоду 2—3 месяца. Консервировать поджелудочную железу можно также поваренной солью. Прибавляют 15% соли по отношению к весу железы и тщательно перемешивают. В таком виде железа хранится до 6 месяцев. Если железа не свежая, а соленая, она удовлетворительно хранится и без глицерина.
Пищевой кислотный казеин в виде сухого желтоватого порошка является отходом молочной промышленности, характеризуется полноценным составом аминокислот и высокой питательностью. Водопроводную воду нагревают до 45°, подщелачивают в открытом сосуде до рН 8,2,
прибавляют 7—10% сухого казеина, высыпая его постепенно при непрерывном помешивании. После прибавления казеина снова устанавливают прежнюю реакцию. Размешивание и подщелачивание производят несколько раз, каждые 30 минут, пока казеин не разбухнет. Тогда добавляют 7—10% фарша из поджелудочной железы или сухого панкреатина, хорошо размешивают и снова подщелачивают до прежней реакции. Через 30 минут опять устанавливают реакцию и переливают смесь в бутыль. В дальнейшем поступают так же, как при изготовлении перевара из мяса. Переваривание казеина при комнатной температуре продолжают 16—20 дней.
Перевар из кровяных сгустков.
Среды из кровяных сгустков характеризуются высокой питательностью и значительной буферностью. Кровяные сгустки промывают на решетке водой и дают воде стечь. Сгустки взвешивают. Наливают в кастрюлю тройное по весу сгустков количество водопроводной воды и доводят ее до кипения. В кипящую воду постепенно опускают сгустки и кипятят 20—30 минут до просветления жидкости; образующуюся пену снимают шумовкой. После кипячения сгустки вынимают из жидкости и нарезают ножом на мелкие кусочки. Заливают в открытом сосуде отваром из расчета на 1 кг сгустков 3 л отвара, подщелачивают до рН 8,0—8,2. Выкипевшее количество жидкости доливают дистиллированной водой. Смесь охлаждают до 37—40°. В дальнейшем поступают, как указано для мясного перевара.
Среды из трипсиновых переваров, особенно из казеина, обладают достаточной буферностью и реакцию после стерилизации не меняют.
Мясо-пептонный бульон (МПБ).
1. В 1 л мясной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1%) и 5 г (0,5%) хлористого натрия. Рекомендуется брать 3 части хлористого натрия и 2 части двузамещенного фосфорнокислого натрия. Смесь вводится в количестве 0,5%. Фосфорнокислый натрий стабилизирует реакцию среды и служит дополнительным источником фосфора. Устанавливают рН среды до 7,6—7,8, кипятят 30—45 минут до выпадения осадка.
2. Охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, доливают водой до первоначального объема, проверяют рН.
3. Разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют 15— 20 минут в автоклаве при 120°С.
Концентрированный мясо-пептонный бульон готовят на особой мясной воде (1 кг мяса заливают 1 л воды). Такой бульон служит для выращивания анаэробных и других микробов.
Мясо-пептонный агар (МПА).
1. К мясо-пептонному бульону для придания плотности добавляют 2—2,5% мелко нарезанного и промытого агар-агара.
Агар-агар получают путем специальной обработки морских водорослей. Он является веществом полисахаридной природы, содержит незначительное количество азота и не представляет собой питательный субстрат. Студень, образуемый агар-агаром, расплавляется при 70— 100°C и застывает при 40—50°.
2. Кипятят, помешивая, до полного расплавления агара. В некоторых случаях для просветления среды прибавляют белок одного куриного яйца, смешанного с двойным количеством холодной воды. Среду помещают в автоклав на 45 минут при 115°С. Свернувшиеся хлопья белка адсорбируют взвешенные частицы и осаждаются на дно.
3. Проверяют и исправляют реакцию среды. Отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем автоклаве или в специальной металлической воронке с двойными стенками, между которыми находится горячая вода.
4. Разливают среду через стеклянную воронку с зажимом в пробирки и флаконы и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15—20 минут.
5. Из расплавленного стерильного мясо-пептонного агара приготовляют скошенный и прямой агар (агар столбиком). В первом случае пробирки укладывают горизонтально до полного застывания, во втором — пробирки помещают в штатив вертикально.
В настоящее время бактериологические лаборатории широко используют сухие питательные среды в виде порошков, хранящихся в герметически закрытых банках и пакетах.
Кроме обычных питательных сред (МПБ и МПА), имеются специальные и дифференциально-диагностические среды. Готовят среды по прописи, указанной на этикетке, навеску порошка растворяют в определенном объеме дистиллированной воды, среду разливают в пробирки и стерилизуют при соответствующей температуре. Постоянство состава, стандартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуществом сухих питательных сред.
Для определения рН плотных питательных сред их расплавляют. Определяют pH с использованием pH-метров или (менее точно) с помощью индикаторной бумаги.
После установления соответствующего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.
Плотные питательные среды
Питательные свойства плотной среды зависят исключительно от состава питательного бульона, из которого она изготовлена путем добавления агар-агара или желатины. Последние служат как желирующие вещества для создания плотности среды.
К мясопептонному бульону или бульону Хоттингера 1 (рН 8,2—8,4) добавляют 2—2,5% отечественного или 2% импортного мелко нарезанного агар-агара. К дрожжевому аутолизату необходимо добавить и 0,5% поваренной соли. Концентрация агара в большой степени зависит от качества агар-агара. Поэтому при употреблении новой партии агара необходимо проверить его желирующую способность. Если агар влажный, его следует до употребления подсушить.
Кастрюлю с бульоном и агаром ставят на огонь и кипятят до полного растворения агара. Во время кипячения необходимо все время помешивать во избежание пригорания. По окончании кипячения следует восстановить объем среды добавлением горячей дистиллированной воды. Проверяют и, если нужно, исправляют реакцию. При определении реакции в агаре или желатине температура этих сред должна быть не ниже 80°, так же как и температура воды, прибавляемой в пробирки компаратора. В противном случае агар или желатина очень быстро становятся плотными, что затрудняет определение. После установления реакции агар кипятят. Дают ему отстояться в теплом месте, после чего фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр. Осадок на фильтр не выливают. Разливают в посуду, стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 30 минут.
При приготовлении больших количеств агара (более 10 л) можно пользоваться другим способом его варки: кастрюлю с агар-агаром на любой питательной основе помещают в автоклав под текучий пар (100°) на 1 час. Текучим паром можно варить агар также в текучепаровом аппарате. Затем оставляют для медленного и равномерного отстаивания в теплом месте (можно оставить в автоклаве с потушенной горелкой) на 1 час, после чего проверяют реакцию, исправляют ее и фильтруют.
Можно после отстаивания дать агару застыть и на другой день срезать и удалить нижнюю его часть с осадком. Прозрачный слой измельчают ножом и расплавляют текучим паром при 100° (1—11/2 часа), после чего устанавливают реакцию и фильтруют. Если после расплавления срезанного агара в нем будет заметна муть, дают ему вновь отстояться в теплом месте, после чего осторожно сливают с осадка. Надо избегать подщелачивания готового агара, так как не исключена возможность выпадения осадка после подщелачивания при последующей стерилизации.
Прозрачный и светлый агар получают также путем просветления его яичным белком или кровяной сывороткой. На каждые 1—2 л агара, остуженного до 50°, прибавляют белок одного куриного яйца или 25—50 мл кровяной сыворотки. Яичный белок нужно предварительно хорошо размешать с двойным объемом холодной воды. Употребляют только свежие яйца, в противном случае агар может сделаться еще более мутным.
После прибавления белка или сыворотки агар тщательно размешивают и кипятят 10-15 минут на огне. Добавленный белок свертывается и адсорбирует взвешенные частицы. Крупно хлопчатый осадок легко отделяется фильтрованием.
Фильтрованный агар разливают в посуду, стерилизуют в автоклаве под давлением 1 атм. в течение 30 минут. После стерилизации питательный агар, разлитый в пробирки, оставляют застыть столбиком, если он приготовлен не для немедленного использования, или скашивают (косой агар) для непосредственного употребления. Для скашивания пробирки с горячим агаром укладывают на покатой поверхности или под верхнюю часть пробирок подкладывают резиновую или стеклянную трубку. После остывания на агаровой среде собирается конденсационная жидкость, которая сохраняется некоторое время, если среду хранить в прохладном месте.
Рост микробов на влажном агаре лучше, чем на сухом. Последний следует расплавить и дать ему снова застыть, тогда выделится снова конденсационная вода. Однако многократное кипячение агара и особенно стерилизация снижают его плотность.
Для разливки в чашки Петри пользуются агаром из флаконов или пробирок. Непосредственно перед разливкой агар следует растопить в водяной бане или текучепаровом аппарате, а затем остудить до 50—55°. Чашки Петри должны быть стерильны. Срок годности чашек со средой до 48 часов. Хранить их следует на холоду.
Сухие питательные среды
В последние годы в бактериологии широко пользуются сухими питательными средами. Это избавляет лаборатории от громоздкого процесса приготовления обычных сред, позволяет получать сравнимые результаты в разных лабораториях и, наконец, приближает к разрешению вопроса о стандартности питательных сред. Значение сухих сред возрастает в экспедиционных и полевых условиях.
Сухие питательные среды следует хранить герметически закрытыми и по возможности не на свету, так как препараты гигроскопичны и светочувствительны. Увлажнение, комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о понижении качества препарата. Сухие препараты, не содержащие глюкозы, даже при комковании могут не терять своих качеств, однако их пригодность следует проверить. При наличии же в сухой среде глюкозы комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о порче.
Технология приготовления питательных сред из сухих препаратов проста. Навеску, указанную на этикетке, всыпают в стеклянную колбу или бутыль с холодной дистиллированной водой. Смесь следует хорошо размешать до полного смачивания порошка водой. Затем в водяной бане или лучше в текучепаровом аппарате смесь нагревают до кипения, периодически помешивая. Кипятят до тех пор, пока порошок окончательно не растворится. Растворение на голом огне возможно, но требует большого внимания, чтобы не допустить пригорания среды. Перед разливкой следует среду хорошо перемешать. Сухие среды выпускаются основные, элективные и дифференциальные.
Сухой питательный агар (рН 7,3—7,6).
К растворенному сухому агару (5—7,5 г сухого агара на 100 мл) рекомендуется добавлять в качестве факторов роста небольшое количество дрожжевого аутолизата, мясной воды или неразведенного триптического перевара мяса (около 1/3 растворяющей жидкости). Для выявления валообразования паратифозной В палочки, а также расщепления бактерий Зонне на круглые и плоские варианты сухой агар растворяют дистиллированной водой, содержащей триптический перевар, в отношении 2:1. Если после растворения агар недостаточно прозрачен, его фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают по пробиркам или флаконам. Стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 20 минут.
