в чем заключается метод соматической гибридизации клеток
Биология. 11 класс
§ 38. Изучение наследственности и изменчивости человека
Основные закономерности наследственности и изменчивости, установленные для живых организмов, носят универсальный характер, а значит, применимы и к человеку. Однако как объект генетических исследований человек имеет свою специфику. Так, для человека характерны медленная смена поколений, небольшое количество потомков в семьях и сложный кариотип, включающий 23 группы сцепления. Кроме того, у людей нельзя экспериментально вызывать мутации, применять к ним гибридологический метод (т. е. осуществлять направленные скрещивания). Эти и другие особенности затрудняют изучение наследственности и изменчивости человека.
Тем не менее в связи с исключительной практической значимостью, благодаря использованию разнообразных методов исследований, генетика человека на сегодняшний день достигла существенных успехов. Важнейшими методами изучения наследственности и изменчивости человека являются следующие.
Близнецовый метод, *введенный английским ученым Ф. Гальтоном в 1876 г.,* заключается в сравнительном изучении признаков у близнецов. Различают дизиготных (разнояйцевых) и монозиготных (однояйцевых) близнецов.
Если в организме женщины одновременно созрели две яйцеклетки, которые далее были оплодотворены разными сперматозоидами, из образовавшихся зигот развиваются дизиготные близнецы. Они обладают различными генотипами. Поэтому разнояйцевые близнецы похожи друг на друга не более чем обычные братья или сестры, причем они могут быть как одного пола, так и разнополыми.
Монозиготные близнецы, как вы уже знаете, развиваются из одной зиготы, которая в ходе дробления дает начало двум или более эмбрионам. Следовательно, эти близнецы имеют одинаковый генотип. Поэтому они всегда одного пола, обладают поразительным внешним сходством, имеют одинаковые отпечатки пальцев, кровь одной и той же группы и т. д.
В человеческих популяциях близнецы рождаются с частотой около 1 %, из них примерно составляют однояйцевые. Для изучения наследственности и изменчивости человека монозиготные близнецы представляют особый интерес. Сходство однояйцевых близнецов обусловлено идентичностью генотипов (см. рис. 36.2 ). В то же время отличия, которые проявляются между ними в ходе онтогенеза, связаны прежде всего с разными условиями жизни (питание, профессиональная деятельность, образ жизни, климат и др.). Таким образом, изучение монозиготных близнецов позволяет определить роль генотипа и условий окружающей среды в развитии тех или иных признаков человека.
VIII. Методы генетики соматических клеток
С помощью этих методов изучают наследственность и изменчивость соматических клеток, что в значительной мере компенсирует невозможность применения к человеку гибридологического метода.
Культуры соматических клеток человека получают из материала биопсий (периферическая кровь, кожа, опухолевая ткань, ткань эмбриона, клетки из околоплодной жидкости).
В генетике человека используют следующие четыре метода.
1. Простое культивирование – клетки пригодны для цитогенетических, биохимических, иммунологических и др. исследований.
2. Клонирование – получение потомков одной клетки. Дает возможность проводить в генетически идентичных клетках биохимический анализ наследственно обусловленных процессов.
3. Селекция соматических клеток с помощью искусственных сред используется для отбора мутантных клеток с некоторыми свойствами, отбор гибридных клеток. Метод широко используется для изучения генных мутаций ( механизмы, спонтанная и индуцируемая частота).
Утрата хромосом носит случайный характер и поэтому среди большого числа гибридов всегда можно найти клетку, сохранившую какую-нибудь одну хромосому человека.
Используя подходящую селективную систему, можно отобрать клетки с определенной ферментативной активностью и локализовать ген этого фермента на конкретной хромосоме.
Метод используется для изучения проблемы сцепления и локализации генов.
Можно изучать механизмы первичного действия и взаимодействия генов, регуляцию генной активности. Метод позволяет широко изучать патогенез наследственных болезней на биохимическом и клеточном уровне.
IX. Создание моделей наследственных болезней человека с помощью трансгенных
Животных.
Биологическое моделирование наследственных болезней представляет собой большой раздел экспериментальных биологии и генетики. Принцип биологического моделирования генных мутаций основан на законе гомологичных рядов в наследственной изменчивости, открытом Н.И.Вавиловым. У животных встречаются мутации, вызывающие такой же патологический эффект, как и у человека (мыши, кролики, собаки, хомяки, мыши). Среди наследственных аномалий у животных встречаются такие заболевания как, гемофилия, ахондроплазия, мышечная дистрофия, сахарный диабет и многие другие, составляющие основу наследственной патологии человека.
Методы основаны на введении чужеродных генов в клетки зародышей.
Как и всякая модель мутантные линии трансгенных животных не могут полностью воспроизвести наследственное заболевание, поэтому моделируются какие-то определенные фрагменты с целью изучения первичного механизма действия генов, патогенеза заболевания разработки принципов его лечения.
Соматическая гибридизация
Разработка способов индукции слияния протопластов вместе с развитием экспериментальной техники культивирования клеток in vitro, дающей возможность получения изолированных протопластов, их культивирования и образования каллуса и в дальнейшем целого растения, сформировало новый очень интересный и перспективный метод гибридизации растений — парасексуальную, или соматическую, гибридизацию.
Сущность этого способа гибридизации заключается в том, что в качестве родительских используются не половые клетки (гаметы), а клетки тела (сомы) растений, из которых изолируют протопласты.
Соматическая гибридизация — это метод создания неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов (родов, семейств) растений, между которыми невозможно половое скрещивание, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров.
Другим способом получения соматических гибридов является электрослияние. Слияние, индуцируемое электрическими импульсами, можно объяснить следующим образом. Импульс короткой продолжительности вызывает диэлектрическое разрушение соприкасающихся мембран протопластов. Вокруг дырки возможен обмен липидными молекулами, образование липидных мостов, что в конце концов приводит к слиянию мембран. Это энергетически более выгодное состояние, чем существование двух поврежденных мембран. Процессы, сопровождающиеся обменом липидов, отражают особенности жидкой мозаичной структуры клеточной мембраны и могут быть связаны с ее текучестью.
В отличие от полового скрещивания, где имеет место передача цитоплазмы только от материнского организма, при соматической гибридизации в образовавшемся гибриде оба партнера имеют более или менее равный цитоплазматический статус. Слияние протопластов способствует объединению двух различных цитоплазм. В большинстве исследований слияние протопластов высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих партнеров, ядро — одного. Образование растения с гибридной цитоплазмой и органеллами обоих партнеров, но содержащее в своих клетках ядро только одного вида, возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер и одно ядро дегенерирует.
Важным моментом в изучении индуцированного слияния двух неродственных протопластов является селективный маркер, используемый для идентификации продукта гетероплазматического слияния, так как эффект индуктора не специфичен и вызывает агрегацию и слияния протопластов как одного и того же вида, так и различных видов. Для идентификации гетероплазматического продукта могут служить пластиды. Например, в случае индуцируемого ПЭГ слияния протопластов сои и капусты гетерокарион получал хлоропласты от капусты и плотную цитоплазму и неокрашенные пластиды от протопластов сои.
При межродовом слиянии протопластов табака и моркови как селективные маркеры использовались зеленые хлоропласты табака и красные, содержащие антоциан, протопласты моркови. Четко различимы были продукты слияния при межвидовой гибридизации между протопластами двух видов Torenia. Протопласты Т. fournieri, содержащие антоциан, комбинировались с протопластами Т. baitlonii, содержащими только хромопласты или только хлоропласты. Кроме пластид могут быть использованы биохимические и генетические маркеры, такие, как изоферментный состав, структура нуклеиновых кислот, устойчивость к антибиотикам, число хромосом, кариотипы.
Основной недостаток метода соматической гибридизации — низкая частота регенерации соматических гибридов, особенно межвидовых и межродовых. В связи с этим соматическую гибридизацию широко применяют у видов с высоким регенерационным потенциалом in vitro, прежде всего семейств Пасленовые, Капустные, Сельдерейные, Лилейные.
С помощью соматической гибридизации между культурными растениями и дикими видами были получены: сорта картофеля, устойчивые к вирусным заболеваниям, фитофторозу, колорадскому жуку; томаты, устойчивые к вирусу табачной мозаики.
Впервые зрелый межвидовой гибрид, полученный в результате парасексуальной гибридизации протопластов 2 сортов табака (Nicotiana glauca c 24 хромосомами и N.langsdorfii c 18 хромосомами), описан Карлсоном в 1972 г. Каллус амфиплоидного гибрида мог расти на безгормональной среде. Гибридное растение цвело. С тех пор были получены жизнеспособные внутривидовые, межвидовые, межродовые гибриды.
Осуществлено слияние протопластов культурного картофеля сорта Приекульский ранний (Solanum tuberosum) с протопластами дикого картофеля (S. chacoense). Известно, что у дикого картофеля клубни очень мелкие. Вместе с тем, растение устойчиво ко многим заболеваниям. Картофель сорта Приекульский ранний образует крупные клубни, но растения этого сорта восприимчивы к болезням. Размеры протопластов у этих растений разные. Соматические гибриды по форме листьев и кустов, размеру клубней занимали промежуточное положение между культурными и дикими растениями. Вместе с тем гибрид, полученный в результате соматической гибридизации, оказался устойчивым к вирусу «У», чем отличался от полового гибрида.
Первая попытка по созданию межродовых гибридов принадлежит Г. Мельхерсу, создавшему в 1978 году гибрид картофель + томат, так называемый томатофель. Гибрид был стерилен, морфологически аномален: толстые корни, отсутствие типичных столонов, махровые цветки. Было еще несколько попыток получения таких гибридов, но все растения стерильны. Эти эксперименты показали ограниченность применения парасексуальной гибридизации для прикладной селекции. Японскими исследователями (Х. Кисака с соавт., 1997) путем электрослияния протопластов ячменя и риса был получен межродовой соматический гибрид.
Протопласты риса получали из суспензионной культуры, а протопласты ячменя были изолированы из молодых листьев. Часть полученных каллусов сформировали зеленые участки и побеги. Только один побег сформировал корни, и это растение было успешно перенесено в почву. По морфологии было близко к растениям риса. Цитологический анализ показал, что растение имело и маленькие хромосомы от риса, и большие от ячменя. Были проанализированы также митохондриальная и хлоропластная ДНК. Растение содержало новые последовательности и в митохондриальной, и в хлоропластной ДНК, которые не обнаруживались ни в одном из родителей.
Была осуществлена гибридизация 2-х родов пасленовых дурмана и красавки. Удалось регенерировать растения. Во всех случаях выявлены хромосомы обоих родительских видов. Регенерировавшие растения были стерильны, похожи на дурман, но содержали небольшое количество хромосом красавки.
В других экспериментах сливали протопласты красавки с каллусными клетками китайского табака. Получили 12 клонов. В клетках всех клонов обнаружили хромосомные типы обоих родителей, через год только у двух клонов происходила полная элиминация хромосом красавки.
Морковь + сныть: из образовавшейся каллусной ткани через полгода регенерировали аномальные растения. Одно из них цвело, но у цветка отсутствовали пыльники и пестик.
Первые работы по получению межсемейственных гибридов проведены К.Као и В.Веттером в 1976-77 гг. (соя + табак). Позднее в лаборатории Ю.Ю.Глебы провели аналогичные эксперименты пасленовые + бобовые и лилейные (горошек + табак и лук + табак). И.Ф.Каневскому удалось индуцировать морфогенез стеблеподобных тератом в культуре межсемейственных гибридов N.tabacum + Vicia faba.
Практически во всех случаях наблюдалась видоспецифичная элиминация хромосом одного из родителей. В культурах межсемейственных гибридов наблюдалось много многоядерных клеток, клеток с мини ядрами, в метафазах делений встречались гигантские хромосомы. Отмечена асинхронность в расхождении родительских хромосом в анафазе. Морфогенез у такого материала отмечен не был.
Для отдаленных гибридов характерно:
1. Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей.
2. Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация хромосом).
3. Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток.
4. Ограниченная морфогенетическая способность.
Изучение межцарственных гибридов клеток «животное + растение» показало, что на этапе слияния видоспецифичность не проявляется, поэтому можно слить даже животную и растительную клетки. На более поздних этапах онтогенеза эти различия сказываются, что было установлено в экспериментах по слиянию протопластов арабидопсиса и табака с лимфоцитами человека. При этом происходило слияние цитоплазмы, ядра не сливались. Эдвард Коккинг параллельно проводил изучение ультраструктуры таких гибридов, работая с клетками амфибий и протопластами моркови. После объединения клеток ядра амфибии были окружены тонким слоем собственной цитоплазмы, но уже через 48 часов отмечалось полное смешивание цитоплазмы и регенерация клеточной стенки вокруг гетерокариона.
Клеточная, генная инженерии. Методы Мичурина
Методы клеточной инженерии (получение соматических гибридов)
1. Соматическая гибридизация — это гибридизация, проведенная между протопластами, которые выделены из растительных соматических клеток. Для получения пригодных для гибридизации протопластов необходимо разрушить внешнюю оболочку клетки специальными ферментами.
2. Так был получен, например, помидофель (томтато) — гибрид томата и картофеля, у которого, как и положено родительским растениям, в земле находятся клубни (картофель), а на стеблях плоды (помидоры).
3. В результате гибридизации соматических клеток можно, во-первых, соединить в ядре гены растений, не имеющих близкого родства, во-вторых, слить цитоплазматические гены партнеров в гибридной клетке.
4. На питательной среде из гибридной растительной клетки можно выращивать клеточную массу — каллюс (или каллус), которая потом дифференцируются в обычное растение, имеющее все органы. Этот гибрид можно высадить в почву и стремительно размножать привычным образом.
Использование соматических мутаций
1. Эти мутации применяют в селекции растений, которые размножаются вегетативно. Такой вид размножения позволяет сберечь полезную соматическую мутацию, размножить любую гетерозиготную форму, которая имеет полезные для сельского хозяйства признаки.
2. Лишь вегетативное размножение позволяет сохранять свойства большого ряда плодово-ягодных культур. Дело в том, что в ходе полового размножения сорта, состоящие из гетерозигот, не сохраняют свои свойства, идет их расщепление.
Методы генной инженерии
1. Бактерия Bacillus thuringiensis нарабатывает эндотоксин (белок). Если бактерия оказывается в желудке насекомого, который вредит посевам, белок вызывает разрушение (лизис) желудочных стенок, вследствие чего насекомое гибнет.
2. В клетки растений исследователи ввели ген, который отвечает за синтез эндотоксина. Оказалось, что если на эти растения запустить гусениц тех самых вредных насекомых, то «доверчивые» гусеницы наедаются листвы, содержащей токсин, и гибнут. Удивительно, но белок смертельно опасен лишь для насекомых, он не оказывает влияния на желудки других животных и человека.
3. Так удалось вывести устойчивые к сельхозвредителям формы томата, картофеля, рапса, табака. Можно сказать, что это одно из первых важнейших практических достижений генной инженерии в селекции растений.
Методы селекции растений, открытые И. В. Мичуриным
1. Шесть десятков лет крупнейший русский биолог Иван Владимирович Мичурин отдал селекции растений. На первых этапах деятельности он намеревался добиться акклиматизации южных сортов в северных широтах. К сожалению, растения вымерзали, и тогда ученый начал разрабатывать методы селекции.
2. База Мичурина — сочетание тройки ведущих методов: отбор, гибридизация, воздействие различных условий окружающей среды на гибриды.
3. Отбор форм для гибридизации велся Мичуриным тщательно. Он производил скрещивание южных изнеженных сортов с «закаленными» северными, затем отбирал лучшие сеянцы и помещал их в достаточно суровые условия для «воспитания стойкости». Так удалось вывести, например, сорт яблок Славянка, гибрид неприхотливой северной Антоновки и южного гостя Ранета ананасного.
4. Мичурин много экспериментировал с сортами, произрастающими в разных регионах и не присущих тому месту, где он работал (город Козлов, сейчас Мичуринск). Так биолог вывел в 1908 году поздний, очень плодовитый сорт яблок Бельфлёр-китайка — от яблони Китайки крупноплодной, растущей в Сибири, и «американца» Бельфлёра желтого.
5. Также Мичурин трудился над созданием отдаленных гибридов — он скрестил, например, малину с ежевикой, рябину с боярышником.
Для устранения негативных последствий отдаленной гибридизации Иван Владимирович Мичурин использовал следующие приемы:
1. Метод вегетативного сближения. Он заключался в предварительной прививке одного вида на другой. В результате меняется химический состав тканей растения, включая генеративные органы. Это повышает вероятность прорастания в пестике пыльцевых трубок. Именно так удалось создать гибрид груши и рябины.
2. Опыление пыльцевой смесью для стимуляции прорастания пыльцевых трубок. «Своя» пыльца «дразнит» рыльце пестика, который начинает воспринимать и «чужую» пыльцу как «свою». Этим способом выведены гибриды яблони и груши, черемухи и вишни (цепарадус).
3. Метод посредника. Сначала Мичурин скрестил дикий персик Давида с диким миндалем, получив гибрид — миндаль Посредник. Затем Посредник был скрещен с культурным сортом персика. В результате получен морозоустойчивый «северный персик».